冠心病穩(wěn)定性心絞痛痰瘀互結(jié)證多中心、小樣本、精細化臨床研究方案*

徐一蘭，高 杉，許慧愚，李 琳，高樹明，邊育紅，崔元璐，李遇伯，李 正，于春泉

（天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

1 研究背景

冠心病穩(wěn)定型心絞痛主要誘因有飲食、吸煙、飲酒、體質(zhì)量過高、運動過少、高血壓以及糖尿病等[1]。近年來，本病發(fā)病率以及病死率居高不下，并且隨著年齡的增高呈上升趨勢[2-3]?！?016年中國衛(wèi)生和計劃生育統(tǒng)計年鑒》中指出中國城市和農(nóng)村居民冠心病穩(wěn)定型心絞痛病死率分別為110.67/10萬和110.91/10 萬[4]。

中醫(yī)學將冠心病穩(wěn)定型心絞痛歸于胸痹、心痛范疇。毛靜遠等[5]通過對全國范圍冠心病中醫(yī)臨床流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，通過中醫(yī)辨證治療的冠心病患者血瘀、痰濁等標實證候要素及相關(guān)的證候類型近年來所占比例不斷增加。由于中醫(yī)在疾病診斷方面的復(fù)雜和多樣性，使得早期多數(shù)實驗研究以臨床藥物的療效為切入點，例如三七和丹紅注射液等[6-7]。近年來隨著系統(tǒng)生物學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)中醫(yī)理論體系的整體觀與現(xiàn)代的系統(tǒng)生物學從基因、細胞、個體組織相結(jié)合的研究方法類似[8-10]，但研究因素較為單一。本研究采取了多中心、小樣本、精細化的臨床研究，嚴格篩選病例并且設(shè)置健康和疾病對照組對痰瘀互結(jié)證進行研究。7家臨床單位配合，檢測28項涉及7類的臨床生化指標，并檢測代謝組學和基因組學，以此方法對痰瘀互結(jié)證的生物學進行探討。

2 研究方法

2.1 參與者與研究單位

2.1.1 樣本含量的估計 按照前瞻性臨床研究樣本含量估算公式：

其中 p=（p1+p2）/2，q1=1-p，p1、p2分別為冠心病痰瘀互結(jié)證與冠心病氣陰兩虛證的患病率，按α=0.05，β=0.10、對應(yīng)的 uα、uβ可查 u 值表，uα=1.644 9，uβ=1.281 6，控制失訪率在20%以內(nèi)。根據(jù)既往臨床試驗數(shù)據(jù)、經(jīng)驗估算樣本量，初步確定前瞻性臨床研究樣本量120例，包括冠心病痰瘀互結(jié)證40例，冠心病氣陰兩虛證40例，健康人40例，每組男性例數(shù)不少于50%。

2.1.2 臨床單位分布與病例數(shù) 本研究根據(jù)中國地域特點與不同地域的人群特征，形成的冠心病研究醫(yī)療單位協(xié)作網(wǎng)。共包括7家臨床單位，各臨床研究單位名稱及承擔的病例數(shù)見表1。

2.2 納入與排除標準

2.2.1 西醫(yī)診斷標準 冠心病穩(wěn)定性心絞痛診斷標準：參照美國心臟病學會和心臟協(xié)會（ACC/AHA）制定的有關(guān)冠心病心絞痛診斷指南，參考《2007年中國慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南》[11]制定冠

心病及其臨床類型的診斷標準。符合以下任何一項或多項即可診斷：1）有明確的陳舊性心肌梗死病史。2）曾行冠狀動脈造影或冠狀動脈電子計算機斷層掃描造影（CTA）檢查提示冠狀動脈至少一支主要分支管腔直徑狹窄≥50%。3）曾接受冠狀動脈血運重建[冠狀動脈介入術(shù)（PCI）或冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG）]治療。

表1 臨床研究單位所需承擔的病例數(shù)Tab.1 Cases assumed by each clinical unit

排除診斷：冠心病不穩(wěn)定性心絞痛的診斷參照2007年中華醫(yī)學會心血管病學分會、中華心血管病雜志編輯委員會《不穩(wěn)定性心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南》，包括如下亞型：1）靜息性心絞痛：心絞痛發(fā)作在休息時，并且持續(xù)時間通常在20 min以上。2）初發(fā)心絞痛：1個月內(nèi)新發(fā)心絞痛，可表現(xiàn)為自發(fā)性發(fā)作與勞力性發(fā)作并存，疼痛分級在III級以上。3）惡化勞力型心絞痛：既往有心絞痛病史，近1個月內(nèi)心絞痛惡化加重，發(fā)作次數(shù)頻繁、時間延長或痛閾降低（心絞痛分級至少增加I級，或至少達到III級）。4）變異性心絞痛：通常是自發(fā)性。其特點是一過性ST段抬高,多數(shù)自行緩解,不演變?yōu)樾募」Ｋ溃贁?shù)可演變成心肌梗死。動脈硬化斑塊導(dǎo)致局部內(nèi)皮功能紊亂和冠狀動脈痙攣是其發(fā)病原因，硝酸甘油和鈣離子拮抗劑可以使其緩解。

2.2.2 冠心病痰瘀互結(jié)證患者納入標準 冠心病痰瘀互結(jié)證的診斷標準參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》和2014年P(guān)CI術(shù)后胸痛中醫(yī)診療專家共識修訂：1）癥狀：胸悶/胸痛。2）舌象：舌質(zhì)紫暗（黯），舌有瘀斑瘀點、舌下脈絡(luò)青紫，苔膩。3）脈象：脈弦滑。（以上3項同時具備，確立診斷。必要時參考表2冠心病痰瘀互結(jié)證辨證標準。）

2.2.3 冠心病氣陰兩虛證患者納入標準 冠心病氣陰兩虛證的診斷標準參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》和2014年P(guān)CI術(shù)后胸痛中醫(yī)診療專家共識修訂：1）主癥：胸悶隱痛，時作時止。2）次癥：心悸氣短，倦怠懶言，口燥咽干，易出汗，頭暈，失眠多夢。3）舌淡紅，胖大邊有齒痕，少苔或無苔，脈細數(shù)或細緩。

表2 冠心病痰瘀互結(jié)證辨證標準Tab.2 Differentiation standard of phlegm and blood stasis syndrome of coronary heart disease

2.2.4 健康人納入標準 健康人年齡為35歲≤年齡≤65歲，參照課題組既往研究建立的健康人標準，排除軀體性疾病包括：排除已經(jīng)明確被診斷患有各種疾?。ò凑誌CD-10）的居民；物理檢查，如測血壓、身高、體質(zhì)量、觀察步態(tài)、外型；詢問既往病史、家族史、女性經(jīng)帶胎產(chǎn)史；醫(yī)院體檢排查（排除已患病但居民自己尚未發(fā)現(xiàn)），利用心肺聽診、查體、心電圖、X-線片（胸、腹、頸椎等）、B 超（肝膽脾腎）、實驗室血液生化檢查等（血糖、血脂、肝功能、肝炎標志物）、必要行CT、冠狀動脈造影；女性婦科專項檢查。

2.2.5 病例排除標準 對于以下患者予以排除：1）3個月內(nèi)發(fā)生過心肌梗死或不穩(wěn)定性心絞痛史、或進行過冠狀動脈血運重建術(shù)（外科搭橋手術(shù)或血管成形術(shù)）。2）合并其他心臟疾病、神經(jīng)官能癥、更年期綜合征、甲狀腺功能亢進、脊髓型或椎動脈型頸椎病、胃-食管返流病或食道裂孔疝等可能引起胸痛的疾病。3）使用β受體阻滯劑、鈣離子通道阻滯劑、能量代謝藥物、硝酸酯類藥物此4類藥物超過3種者。4）合并高血壓病并經(jīng)降壓藥物治療后血壓仍偏高者（收縮壓≥160 mmHg，舒張壓≥100 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa），重度心肺功能不全，重度心律失常（快速心房纖顫、心房撲動、陣發(fā)性室性心動過速等）。5）合并活動性肝臟疾病，或伴有原因不明的血清轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)升高，或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）＞2倍正常參考值上限者。6）腎功能異常者。7）合并造血系統(tǒng)或惡性腫瘤等嚴重原發(fā)性疾病者。8）孕婦、哺乳期婦女或有生育要求的育齡婦女。9）精神病患者，或認知功能障礙。10）患有糖尿病腎病、痛風性腎病等嚴重代謝性疾病者。11）預(yù)計依從性差，不能定期訪視的患者。12）最近3個月內(nèi)參加過其他臨床試驗者。13）研究者認為存在不適合參加該試驗的其他情況。

2.3 干預(yù)措施 冠心病患者研究期間可維持入組前原方案治療，入組導(dǎo)入期為2周，使患者病情穩(wěn)定，符合入組標準。療程8周，第12周隨訪1次。西醫(yī)常規(guī)治療參照“2007年中國慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南”，包括吸氧、休息、β受體阻滯劑、鈣離子通道阻滯劑、能量代謝藥物、硝酸酯類藥物等。冠心病痰瘀互結(jié)證組給予西醫(yī)常規(guī)治療，加用丹蔞片（生產(chǎn)廠家：吉林康乃爾藥業(yè)有限公司，批號：20150112，規(guī)格：每片 0.3 g），5 片/次，每日 3 次，療程8周。冠心病氣陰兩虛證組給予西醫(yī)常規(guī)治療，加用通脈養(yǎng)心丸（生產(chǎn)廠家：天津中新藥業(yè)集團股份有限公司，規(guī)格：每10丸1 g，批號：B107915），40丸/次，每日2次，療程8周。健康人對照組不予藥物干預(yù)。

2.4 合并用藥規(guī)定 患者入組前正在服用治療冠心病的阿司匹林、他汀類等6類藥物者，研究期間可維持入組前方案治療，使用β受體阻滯劑、鈣離子通道拮抗劑、能量代謝藥物、硝酸酯類藥物此4類藥物不允許超過3種。除此之外，禁止加用除研究用藥外的其他任何對冠心病有治療作用的中、西藥物。

2.5 采集信息與檢測內(nèi)容

2.5.1 冠心病痰瘀互結(jié)證量表學評價 使用冠心病痰瘀互結(jié)證病例報告表（CRF）、冠心病痰瘀互結(jié)證中醫(yī)證候評價量表、西雅圖心絞痛量表（SAQ）、癥狀自評量表（SCL-90）、生存質(zhì)量量表（SF-36）對受試者進行評價，檢測時點為第0、4、8、12周。

2.5.2 冠心病相關(guān)指標檢測 人口學資料包括患者性別、年齡、民族、職業(yè)、血壓（BP）、心電圖等。

檢測的生化指標共7類28項，包括：1）內(nèi)皮損傷指標：血管緊張素Ⅰ（ANG-Ⅰ）等。2）脂質(zhì)代謝指標：總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）等。3）黏附分子指標：E選擇素（E-selection）等。4）金屬蛋白酶：金屬蛋白酶 9（MMP9）、金屬蛋白酶 2（MMP2）。5）同型半胱氨酸（Hcy）。6）炎癥介質(zhì)指標：腫瘤壞死因子（TNF-α）、核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κb）等。7）凝血功能指標：凝血酶時間（TT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）等。

以上指標由天津金域醫(yī)學檢驗所有限公司集中進行檢測。

2.5.3 基因組學檢測 在上述樣本中選取冠心病痰瘀互結(jié)證（8例），冠心病氣陰兩虛證（8例），健康人（8例）進行表達譜芯片檢測，冠心病痰瘀互結(jié)組、冠心病氣陰兩虛組的檢測時點為第0、8周，健康人的檢測時點為第0周。

2.5.4 代謝組學檢測 分別收集各組受試者清晨空腹血樣和尿樣，-80℃保存?zhèn)溆谩９谛牟√叼龌ソY(jié)組、冠心病氣陰兩虛組檢測時點為第0、8周，健康人檢測時點為第0周，進行代謝組學研究。

2.5.5 指標檢測注意事項 1）制定嚴格的納入和排除標準，選擇依從性較好的患者，保證按時用藥，代謝組學檢查注意避免代謝性疾病的干擾。2）測定臨床生化指標前禁食12 h，并且24 h內(nèi)不應(yīng)進行劇烈體育運動。3）樣品收集以1個月為期限，每個月集中運輸收集的樣品，生物樣品需保存在-80℃冰箱，理論上在6個月之內(nèi)分析完所有樣品檢測工作。

2.6 質(zhì)量控制及依從性估算 為了保證研究的順利進行，臨床試驗正式啟動前課題組要召開專門的臨床培訓(xùn)會，對各中心臨床研究者進行統(tǒng)一培訓(xùn)，以提高研究人員的內(nèi)部觀察一致性和觀察者之間一致性，保證臨床研究結(jié)論的可靠性。簽署研究者聲明，在各參研醫(yī)院實驗室建立各項指標觀測和質(zhì)量控制標準操作規(guī)程（SOP）。研究過程中對各中心進行定期監(jiān)查，控制中心間偏倚。

患者依從性采用服藥量計數(shù)法，借以測估受試者的依從性，以受試者已服藥量80%以上（含80%）作為判別標準，其計算公式如下：

2.7 觀察中止標準 觀察中止標準：1）由課題組專門成立的數(shù)據(jù)安全監(jiān)察委員會（DSMB），全權(quán)負責安全性和中期療效評估，根據(jù)其對嚴重不良事件的監(jiān)測，判斷是否終止整個臨床試驗。2）每個中心一名心內(nèi)科醫(yī)生負責評估研究中出現(xiàn)的嚴重不良反應(yīng)，確定是否繼續(xù)或中止研究。3）研究期間受試者出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥或其他嚴重疾病，需采取緊急措施者。4）受試患者撤回知情同意。

2.8 數(shù)據(jù)管理 本項目采用紙板CRF，所有CRF經(jīng)過研究者審核并簽名批準后生效。所有的CRF和CRF修改痕跡均保留。制定CRF數(shù)據(jù)核查表，采用有專業(yè)背景的雙人背靠背方式對紙板CRF數(shù)據(jù)進行核查。若出現(xiàn)雙人核查結(jié)果不一致的情況，由第三人再進行核查，選擇核查結(jié)果出現(xiàn)一致的為準。

采用Epidata3.1建立數(shù)據(jù)庫，由培訓(xùn)合格的兩名專業(yè)人員根據(jù)錄入指南進行雙人雙錄入，在錄入后對錄入的數(shù)據(jù)逐一核查。當數(shù)據(jù)核查中所有疑問均已經(jīng)解決，數(shù)據(jù)庫已更新，且數(shù)據(jù)核查未發(fā)現(xiàn)新的疑問時，數(shù)據(jù)庫將予以鎖定。數(shù)據(jù)庫鎖定后，任何數(shù)據(jù)的改動，都需經(jīng)項目負責人批準并由數(shù)據(jù)管理單位備案。

2.9 統(tǒng)計分析 由統(tǒng)計學專家經(jīng)反復(fù)論證制定統(tǒng)一的統(tǒng)計分析方案，交予兩家統(tǒng)計機構(gòu)進行背靠背統(tǒng)計分析。對于統(tǒng)計結(jié)果不一致的情況，進行討論確定最終結(jié)果。統(tǒng)計分析先進行病例剔除、脫落情況分析，檢查各家中心完成例數(shù)、剔除和脫落情況；然后進行患者人口統(tǒng)計學及基線值的同質(zhì)性分析，有效性分析主要包括主次要療效指標的比較等；安全性分析包括實驗室指標異常情況和不良反應(yīng)發(fā)生率的比較。

對定量數(shù)據(jù)，以均數(shù)、標準差、例數(shù)、最小值和最大值，或加用中位數(shù)、上四分位數(shù)、下四分位數(shù)、95%可信區(qū)間做描述性統(tǒng)計分析。組間或組內(nèi)治療前后對比分析，先對變量分布進行正態(tài)檢驗。服從正態(tài)分布時，用t檢驗或自身t檢驗；非正態(tài)分布，用非參數(shù)統(tǒng)計方法。對定性數(shù)據(jù)，以頻數(shù)表、百分率或構(gòu)成比做描述性統(tǒng)計分析。組間或組內(nèi)治療前后對比分析，用χ2檢驗、Fisher精確概率法、Wilcoxon秩和檢驗或Wilcoxon符號秩和檢驗；兩分類指標及等級指標的比較若考慮到中心或其他因素的影響，采用分層χ2檢驗。一般統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P<0.05者被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2.10 安全性評價與倫理學原則 本課題已通過天津中醫(yī)藥大學倫理委員會的倫理審查，倫理審查批件號TJUTCM-EC20150001，并于2015-11-20注冊于美國臨床試驗注冊中心，注冊號NCT02526381,于2015-7-16注冊于中國臨床試驗注冊中心，注冊號ChiCTR-OOC-15006765。

受試者為來源于7個中心的自愿受試者，均獨立簽署知情同意書，并放入CRF插頁中。醫(yī)生將定期進行心電圖、肝功能、腎功能等檢查，密切觀察藥物可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)，必要時停止試驗。如果在研究期間受試者出現(xiàn)任何不適，或病情發(fā)生新的變化，或任何意外情況，不管是否與研究有關(guān)，均應(yīng)及時通知醫(yī)生，醫(yī)師將對此作出判斷并給與適當?shù)尼t(yī)療處理。

3 討論

近年來，隨著經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平的提高，痰瘀互結(jié)證已經(jīng)成為冠心病主要證型之一。本課題依托國家973計劃，研究方案前期經(jīng)副高職稱以上專家數(shù)10次的反復(fù)論證修改，雖不是隨機對照試驗，但是一項多中心、小樣本、精細化的臨床研究。本方案較普通的臨床對照試驗方案設(shè)計上有如下幾點優(yōu)勢：1）小樣本、精細化：本研究對納入的每組40例患者進行精細化研究，通過臨床量表、生化指標、基因組學、代謝組學等多方向多手段，全面探討冠心病痰瘀互結(jié)證的病證方關(guān)系。2）多中心的選擇：由于中國地域遼闊，海拔、溫度及人民生活方式差異也較大，故本研究選取了華東、華北、華中、南部、西部的7家臨床單位進行病例收集，充分考慮到了地域間的差異性，將本臨床觀察地區(qū)及患者體質(zhì)差異的影響降低到較小的范圍。3）合并用藥的規(guī)定：由于冠心病患者多合并高血壓、高脂血癥等其他疾病，或經(jīng)PCI手術(shù)治療，需長期服用降血壓、抗血小板凝集等藥物，本研究對合并用藥情況進行了嚴格規(guī)定，體現(xiàn)了設(shè)計的嚴謹性。4）數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果的處理：考慮到統(tǒng)計方法與臨床結(jié)果的復(fù)雜性，本研究經(jīng)過統(tǒng)計專家反復(fù)論證后制定統(tǒng)一的統(tǒng)計計劃書。采用兩家統(tǒng)計機構(gòu)對數(shù)據(jù)進行背靠背統(tǒng)計分析，并對兩家機構(gòu)統(tǒng)計結(jié)果出現(xiàn)結(jié)果不一致的情況進行研究討論，確定最終結(jié)果，以保證統(tǒng)計結(jié)果的準確與科學性。5）臨床研究的質(zhì)量控制：由于臨床單位不同，為防止收集樣本過程中出現(xiàn)的差異，課題組派出經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)的監(jiān)察稽查人員，對臨床單位進行非現(xiàn)場與現(xiàn)場的監(jiān)察稽查工作，保證收集病例的嚴謹性。CRF的填寫也在培訓(xùn)后進行，并有專業(yè)人員進行現(xiàn)場監(jiān)督核查，后期課題組統(tǒng)一對數(shù)據(jù)進行二輪核查，確保原始數(shù)據(jù)的準確。6）統(tǒng)一的樣本采集與檢測：采集的血液與尿液樣本統(tǒng)一規(guī)格，請中國最早進入生物醫(yī)藥檢測領(lǐng)域的金域檢測集團進行統(tǒng)一運輸、統(tǒng)一管理。生化指標、液態(tài)芯片、表達譜芯片均選擇金域檢測集團進行檢測，保證檢測流程統(tǒng)一。

由于臨床研究的復(fù)雜性，入組個體情況差異與前期治療情況差異較大，雖研究方案對可能出現(xiàn)的問題都進行了嚴格的規(guī)定，但仍可能影響部分研究結(jié)果。后期會根據(jù)實際研究情況進一步完善本類研究的臨床方案。本方案全面詮釋了冠心病痰瘀互結(jié)證臨床生物學基礎(chǔ)研究過程，為冠心病中醫(yī)證候?qū)W研究方案的設(shè)計提供參考范例，也為后續(xù)相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

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