豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2研究進(jìn)展

趙 軍，徐志文，2，朱 玲，2，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

PRRSV是單股正鏈RNA病毒，屬尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)。其基因組全長約15.4 kb，包含10個(gè)ORFs，分別為ORF1a、1b、2a、2b以及ORF3- 5、ORF5a、ORF6- 7。ORF1a在病毒復(fù)制中，先被翻譯成ppla多聚蛋白，ORF1b通過核糖體轉(zhuǎn)移碼轉(zhuǎn)移成pplab多聚蛋白。之后分別被水解為Nsp1- 8和Nsp9- 12等至少16種非結(jié)構(gòu)蛋白[1-3]。PRRSV感染早期Nsp1β、Nsp2、Nsp4、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8定位于細(xì)胞核周圍，原位標(biāo)記顯示它們共定位的位置為病毒RNA復(fù)制場所[4]。

Nsp2基因是PRRSV遺傳流行病學(xué)監(jiān)測和演化的重要基因，當(dāng)前PRRSV多亞型毒株在Nsp2基因區(qū)段均有不同程度的基因插入和缺失。所以關(guān)于Nsp2蛋白與PRRSV毒力、致病性的關(guān)系、對細(xì)胞的侵襲能力的研究越來越多，也越來越深入。Nsp2是PRRSV最大的復(fù)制蛋白，其基因長度約為2.9 kb，不同毒株序列之間變異明顯且基因全長不一。Nsp2保守性最差，美洲型毒株和歐洲型毒株序列比對顯示，氨基酸序列同源性僅為32%，抗原表位眾多，而表位集中區(qū)域容易發(fā)生基因變異。

目前已鑒定Nsp2有4個(gè)主要功能區(qū)：N端的半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(PL2)；功能尚未清楚的中間高變區(qū)；近C端的高親水性跨膜區(qū)；功能尚不明確的C端富含半胱氨酸殘基保守區(qū)。Nsp2蛋白具有順式和反式2種酶切活性，所以酶切后能夠產(chǎn)生7種Nsp2亞型(Nsp2a、Nsp2b、Nsp2c、Nsp2d、Nsp2e、Nsp2f、Nsp2TF)。其中Nsp2TF是最近發(fā)現(xiàn)的能影響PRRSV復(fù)制的新亞型(約占Nsp2的2/3)。這些Nsp2使用相同的N末端和不同的C末端[3,5]。Nsp2是一個(gè)與病毒相關(guān)的PRRSV蛋白，研究表明PRRSV的復(fù)制過程中會(huì)出現(xiàn)大小不一的Nsp2亞類，它們共享PL2區(qū)域的227個(gè)氨基酸的N端。產(chǎn)生的這些不同分子量的Nsp2可能存在不同的功能，大分子Nsp2亞型蛋白在感染早期出現(xiàn)，對病毒的早期復(fù)制可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-7]。Nsp2以多個(gè)亞型存在于病毒包膜上，在病毒包裝時(shí)與病毒的包膜融合有關(guān)，還存在于細(xì)胞突起上，與細(xì)胞之間的聯(lián)系密切相關(guān)，其所誘導(dǎo)的體液免疫所產(chǎn)生的抗體與結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白形成的免疫水平相當(dāng)。其N末端具有保守的催化N末端半胱氨酸和組氨酸殘基的活性，并被認(rèn)為具有半胱氨酸蛋白酶的活性[8]。此外，Nsp2還是Nsp4絲氨酸蛋白酶的輔助因子，與細(xì)胞和組織嗜性有關(guān)，在病毒復(fù)制過程中，參與多聚蛋白的裝配[9]。

當(dāng)前，PRRS對養(yǎng)豬業(yè)造成的沖擊正逐漸加重，特別是2013年以后國內(nèi)多地相繼報(bào)道發(fā)現(xiàn)Nsp2缺失131aa的NADC30類似毒株，使得國內(nèi)PRRSV的防控變得更加復(fù)雜。Nsp2是不同亞型毒株之間變異最明顯也最沒有規(guī)律的蛋白，當(dāng)前對地區(qū)PRRSV的流行病學(xué)調(diào)查及毒株遺傳進(jìn)化分析多以Nsp2基因?yàn)榘谢颉，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，當(dāng)前NADC30類似毒株多發(fā)現(xiàn)于河北、河南、山東、遼寧等省，南方地區(qū)還未見報(bào)道，但基于當(dāng)前交通便利、生豬流動(dòng)大等現(xiàn)狀，NADC30類似毒株何時(shí)能傳入南方，能造成多大困擾還未可知。因此，針對新流行毒株的檢測及其變異后的Nsp2在病毒復(fù)制、致病力和參與免疫調(diào)控方面的研究是很有必要的。

1 Nsp2的高變異性

Nsp2在非結(jié)構(gòu)蛋白中變異性最大，點(diǎn)突變、插入和缺失是PRRSV Nsp2的常見突變。對中國的PRRSV進(jìn)行調(diào)查分析，Nsp2基因具有廣泛的變異性[10]。2006年，我國爆發(fā)了高致病性PRRS(HP- PRRS)，2008年，美國報(bào)道發(fā)現(xiàn)一種新亞型的HP- PRRSV(NADC30)，通過Nsp2的基因序列比較結(jié)果顯示，HP- PRRSV和經(jīng)典PRRSV比較在Nsp2高變區(qū)存在30 aa左右的連續(xù)缺失[11]，而NADC30類型毒株較HP- PRRSV在Nsp2高變區(qū)存在131 aa左右的不連續(xù)缺失[12-14]，從GenBank中收錄的HP- PRRSV、經(jīng)典PRRSV、NADC30類型毒株遺傳進(jìn)化樹分析顯示，NADC30毒株與國內(nèi)主流毒株HP- PRRSV、經(jīng)典PRRSV分屬2個(gè)大的分支，而HP- PRRSV、經(jīng)典PRRSV屬于同一進(jìn)化分支(圖1)。

野毒株自然缺失時(shí)有報(bào)道：本實(shí)驗(yàn)室毛汐語等[15]2012年分離的SC2012自然減毒株，在aa485～aa498區(qū)間連續(xù)缺失14個(gè)氨基酸；Gao等[16]首次報(bào)導(dǎo)了PRRSV Nsp2天然缺失的病毒株HB- 2(SH)/2002，在aa471～aa482區(qū)間連續(xù)缺失12個(gè)氨基酸；Liu等[17]分離的2株歐洲型PRRSV在Nsp2的aa282～aa348區(qū)間連續(xù)缺失68個(gè)氨基酸，同時(shí)還分離出4株北美型PRRSV在aa322～aa432、aa483、aa504～aa522區(qū)間連續(xù)缺失31個(gè)氨基酸[18]；Ji等[19]分離的GZgy15- 1毒株在Nsp2的aa488～aa516區(qū)間缺失29個(gè)氨基酸。另外還發(fā)現(xiàn)，在FJLYDX04株的aa599～aa603序列中有5個(gè)堿基的插入，這是中國第一株報(bào)道Nsp2存在插入的病毒株[20]。此外，病毒株HZ- 31的Nsp2區(qū)含有59個(gè)不連續(xù)缺失，分別為aa467～aa474、aa498～aa519和aa533～aa361，但它的481位未像其他HP- PRRSV株一樣缺失，在遺傳系統(tǒng)中分析，它是獨(dú)立于JXA1和EM2007的一個(gè)單獨(dú)分支[21]。

表1分離株Nsp2變異情況

Table1Nsp2 variation of isolated strains

毒株Strain分離年限Isolationtime分離國家Isolationcountry氨基酸缺失(插入)Aminoaciddeletion(insertion)突變位點(diǎn)Positionrelativetocomparedstrain參考毒株ReferencePRRSVstrain基因類型Genotype登錄號(hào)AccessionNo.HB-2(SH)/20022002China12aa471～482VR-2332NorthAmerican-JXA12006China1aa,29aa483,504～522VR-2332NorthAmericanEF112445GDQY22007China35aa,29aa470～505,532～560VR-2332NorthAmericanGU454850Em20072007China68aa499～566VR-2332NorthAmericanEU262603SC20122012China14aa485～498JXA1NorthAmericanKM189443NADC302011China131aa—JXA1NorthAmericanJN654459HENAN-XINX2013China131aa303,323～433,501～519JXA1NorthAmericanKF611905HZ-312013China8aa,22aa,29aa467～474,498～519,533～561JXA1NorthAmericanKC445138GZgy15-12015China29aa488～516JXA1NorthAmericanKT358728CHsx14012015China111aa323～433JXA1NorthAmericanKP86162515LY02-FJ2015China11aa322～432,483,504～522JXA1NorthAmericanKU215417HNhx2016China111aa,1aa,19aa323～433,483,501～519JXA1NorthAmericanKX766379FJQEU142014China68aa282～348LVEuropeanKP860913

圖1 不同基因類型遺傳進(jìn)化分析Fig.1 Genetic evolution analysis of different gene types

2 Nsp2與PRRSV毒力

從經(jīng)典PRRSV、HP- PRRSV和NADC30類PRRSV的Nsp2變異的情況分析，研究人員們一直懷疑Nsp2的氨基酸缺失導(dǎo)致了HP- PRRSV毒力的增強(qiáng)，但是現(xiàn)已通過多個(gè)強(qiáng)、弱毒株基因片段置換試驗(yàn)證明其與毒力并無關(guān)聯(lián)。Zhou等[22]在HP- PRRSV反向遺傳操作平臺(tái)的基礎(chǔ)上通過分別置換強(qiáng)毒株JXwn6和弱毒株HB- 1/3.9的相對應(yīng)的Nsp2區(qū)域，然后恢復(fù)病毒測定病毒的致病力，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，互相置換了Nsp2相應(yīng)區(qū)域的恢復(fù)毒株與親本株的致病力無異。

Li等[23]在HP- PRRSV反向遺傳操作平臺(tái)的基礎(chǔ)上通過分別置換強(qiáng)毒株JXwn6和弱毒株HB- 1/3.9的5’UTR+ORF1a和ORF1b以及M和N蛋白，然后恢復(fù)病毒測定病毒致病力，結(jié)果表明置換ORF1a的恢復(fù)病毒不管是強(qiáng)毒株還是弱毒株，毒力沒有相應(yīng)減弱或增強(qiáng)。這2個(gè)試驗(yàn)充分表明HP- PRRSV的Nsp2連續(xù)缺失30 aa并不是其毒力增強(qiáng)的主要原因。

3 Nsp2與PRRSV復(fù)制

病毒的復(fù)制有時(shí)需要利用宿主蛋白，但是自身的一些非結(jié)構(gòu)蛋白也會(huì)參與病毒的復(fù)制過程。PRRSV是正鏈RNA病毒，復(fù)制過程在細(xì)胞質(zhì)靠近細(xì)胞核的雙層囊泡中進(jìn)行，而對Nsp2的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其定位于細(xì)胞核周圍，與雙層囊泡的位置相一致，是病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵區(qū)域[24]。王鳳雪等[25]通過將HP- PRRSV弱毒株TJM株的Nsp2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到Marc- 145細(xì)胞中，建立了穩(wěn)定表達(dá)Nsp2蛋白的細(xì)胞系，通過接種病毒測定病毒含量發(fā)現(xiàn)Nsp2蛋白能夠促進(jìn)PRRSV的增殖。在對Nsp2影響PRRSV復(fù)制的深入研究中發(fā)現(xiàn)，Nsp2的aa323～aa433和aa628～aa747雖不是PRRSV復(fù)制的關(guān)鍵位點(diǎn)，但在PRRSV復(fù)制過程中起到了重要的作用[26]。進(jìn)一步通過截?cái)嗟鞍姿矔r(shí)表達(dá)的方式探索Nsp2中缺失的氨基酸與PRRSV復(fù)制是否有關(guān)，發(fā)現(xiàn)TJM株Nsp2中缺失的120 aa中的aa628～aa727能夠抑制病毒的增殖[27]。在對Nsp2的N端的半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(PL2)和功能尚不明確的C端富含半胱氨酸殘基保守區(qū)病毒復(fù)制的影響的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在C末端插入EGFP蛋白并不能對病毒的復(fù)制造成影響，EGFP蛋白能正常表達(dá)，但是對N端的研究表明，PL2的反向切割活性在病毒復(fù)制過程中是非常重要的。進(jìn)一步對其精確的位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，PL2的核心域(aa47～aa180)和直接下游區(qū)域(aa181～aa323)是病毒復(fù)制必不可少的[28-29]。

除Nsp2直接影響病毒的復(fù)制以外，還存在其他途徑影響病毒增殖，細(xì)胞中的一些蛋白質(zhì)也能通過與Nsp2互作來影響PRRSV的復(fù)制，Nsp2招募Bcl2相關(guān)抗凋亡基因6(BAG6)蛋白并利用該蛋白幫助NSP2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)促進(jìn)雙層膜泡的形成[30]。細(xì)胞中的14- 3- 3蛋白家族是常見的蛋白家族，通過激光共聚焦和過表達(dá)最終確定14- 3- 3蛋白能夠作用Nsp2促進(jìn)PRRSV的增殖[31]。Nsp2利用N端的半胱氨酸蛋白酶的去泛素化酶活性抑制凋亡誘導(dǎo)分子1(AIF1)的泛素化降解，從而促進(jìn)PRRSV復(fù)制過程中胞內(nèi)ATP的合成[32]。同時(shí)也有研究表明病毒復(fù)制過程中自身產(chǎn)生的miRNA(微小核糖核酸)能夠直接靶向Nsp2基因來抑制病毒的增殖，形成負(fù)調(diào)控[33]。

總之，通過由簡到繁、由全蛋白到關(guān)鍵位點(diǎn)的對Nsp2影響、參與病毒復(fù)制的研究表明，Nsp2的高變區(qū)域依舊有一些關(guān)鍵位點(diǎn)能夠影響病毒的復(fù)制，其N- 末端和C- 末端的一部分區(qū)域在病毒復(fù)制過程中是至關(guān)重要的。

4 Nsp2與免疫調(diào)控

Nsp2蛋白是病毒蛋白中最大的蛋白，它參與多肽的組合和病毒的復(fù)制等復(fù)雜的過程，并富含抗原表位[34]。近年來，關(guān)于PRRSV對豬免疫抑制的報(bào)道主要集中在對各種細(xì)胞因子的抑制及促進(jìn)方面，以間接反映宿主免疫反應(yīng)情況。Beura等[35]發(fā)現(xiàn)，PRRSV的4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白對IFN- β啟動(dòng)子(IRF- 3)的活性起到有效的抑制作用。依據(jù)它們的影響大小，排序?yàn)镹sp1、Nsp2、Nsp11和Nsp4。Li等[36]證明，Nsp2通過抵抗IFN調(diào)節(jié)因子3(IRF- 3)的活性進(jìn)而強(qiáng)烈地抑制由仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的IFN- β產(chǎn)生。有研究顯示，Nsp2蛋白在PRRSV感染細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)分布，并與RIG- I信號(hào)通路中的一個(gè)銜接分子MAVS和能夠激活細(xì)胞內(nèi)I型IFN信號(hào)通路的信號(hào)分子LSml4A共定位，但不影響IRF- 3或NF- κB入核，表明PRRSV對先天免疫的影響可能在細(xì)胞核內(nèi)[6]。Sun等[37]證明，Nsp2的卵巢腫瘤蛋白酶(OTU)區(qū)域具有泛素連接酶活性，這個(gè)區(qū)域可以通過對IκBα聚泛素化而抑制IκBα的降解，而IκBα是NF- κB的抑制因子，從而抑制NF- κB的活性而抑制IFN- I的產(chǎn)生。而Fang等[38]證明，PRRSV WUH3株Nsp2蛋白的過量表達(dá)能夠誘導(dǎo)IκBα降解，激活NF- κB。并且確定了Nsp2的高變區(qū)(aa179～aa782)對于激活NF- κB是不可缺少的，并且它所刺激的活性與Nsp2全長基本一致。非結(jié)構(gòu)蛋白還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN- γ和IL- 10。Burgara- Estrella等[39]通過動(dòng)物試驗(yàn)確定PRRSV Nsp2的非保守多肽(589SLYKLLLEV597)可以引起豬的免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生IFN- γ。Xing等[26]通過缺失多株P(guān)RRSV Nsp2高變區(qū)的片段研究其對機(jī)體免疫誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)缺失aa322～aa434、aa531～aa561和aa531～aa561、aa627～aa748的恢復(fù)毒株誘導(dǎo)IL- 1β、IL- 6和TNF- α的能力降低，但aa531～aa561、aa627～aa748缺失株卻能強(qiáng)烈誘導(dǎo)IL- 12(P40)的表達(dá)。

5 Nsp2的可插入位點(diǎn)與分子標(biāo)簽

Nsp2的非必需區(qū)域能夠插入表達(dá)外源蛋白，目前關(guān)于對Nsp2插入外源蛋白的位點(diǎn)和外源蛋白的種類做了很多的研究。同時(shí)由于Nsp2的高突變導(dǎo)致其不同亞型之間插入和缺失突變非常嚴(yán)重，能夠利用其毒株之間的插入和缺失來區(qū)分毒株亞型，同樣也起到分子標(biāo)簽的作用[40]。

Kim等[41]通過在Nsp2非關(guān)鍵區(qū)進(jìn)行缺失并插入肽標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)拯救病毒株毒力顯著降低，并能被特異抗原包被的ELISA試劑盒檢測，再次驗(yàn)證了Nsp2是用來發(fā)展標(biāo)記疫苗和弱毒苗的潛在靶基因。Xu等[42]在對疫苗毒HuN4- F112 Nsp2復(fù)制非關(guān)鍵區(qū)缺失25個(gè)氨基酸，并插入新城疫病毒N蛋白免疫顯性B細(xì)胞表位49個(gè)氨基酸作為一種基因標(biāo)記疫苗，在動(dòng)物體內(nèi)能同時(shí)產(chǎn)生對抗NDV NP及PRRSV的特異性抗體，而且缺乏針對缺失的25個(gè)氨基酸的抗體，免疫豬獲得很好的免疫保護(hù)，該疫苗可以作為一種有效的對抗PRRSV的基因標(biāo)記苗。

Yu等[43]利用反向遺傳操作平臺(tái)將豬的粒細(xì)胞- 巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM- CSF)插入到HuN- F112的ORF1b與ORF2a之間作為分子標(biāo)記，后續(xù)試驗(yàn)表明GM- CSF能夠穩(wěn)定地隨著病毒復(fù)制而表達(dá)，說明在這一區(qū)域能夠允許外源蛋白的插入。

6 展望

隨著對PRRSV Nsp2蛋白的深入研究，Nsp2在病毒復(fù)制、致病性、機(jī)體相互作用方面的作用也越來越清晰。Nsp2基因在不同亞型中的特征性變異，為PRRSV變異亞型的鑒定提供依據(jù)，同時(shí)，這些研究也揭示了Nsp2氨基酸的變異不是PRRSV的毒力改變的主要因素，但是Nsp2蛋白在PRRSV的復(fù)制、免疫調(diào)控等方面扮演著重要的角色。Nsp2 能夠直接影響病毒的復(fù)制，并且Nsp2也能通過與細(xì)胞中的一些蛋白質(zhì)互作來影響PRRSV的復(fù)制。Nsp2對IFN- β啟動(dòng)子(IRF- 3)的活性起到有效的抑制作用，從而抑制病毒誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IFN- β。Nsp2的卵巢腫瘤蛋白酶(OUT)區(qū)域可以通過對IκBα聚泛素化而抑制IκBα的降解，從而抑制NF- κB的活性而抑制IFN- I的產(chǎn)生。Nsp2的高變區(qū)(aa179～aa782)對于激活NF- κB是不可缺少的。同時(shí)，Nsp2非必需區(qū)域的高變性為PRRSV作為載體插入外源蛋白和分子標(biāo)簽提供了可能。對Nsp2蛋白的功能研究有助于闡明PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白參與免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)Nsp2蛋白的遺傳變異研究有助于相關(guān)重組疫苗的研究和分子標(biāo)簽的應(yīng)用，為疫苗株和野毒株的鑒定提供參照。

[1] FANG Y, SNIJDER E J. The PRRSV replicase: exploring the multifunctionality of an intriguing set of nonstructural proteins[J].VirusResearch, 2010, 154(1/2)：61-76.

[2] FANG Y, TREFFERS E E, LI Y, et al. Efficient- 2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 2012, 109(43)：E2920-E2928.

[3] LI Y, TREFFERS E E, NAPTHINE S, et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 2014, 111(21)：2172-2181.

[4] LI Y, TAS A, SNIJDER E J, et al. Identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus ORF1a- encoded non- structural proteins in virus- infected cells[J].JournalofGeneralVirology, 2012, 93(4)：829-839.

[5] HAN J, RUTHERFORD M S, FAABERG K S. Proteolytic products of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp2 replicase protein[J].JournalofVirology, 2010, 84(19)：10102-10112.

[6] 溫貴蘭, 張涵淞, 扈鴻霞, 等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染細(xì)胞中非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2表達(dá)分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 44(7)：1109-1116.

WEN G L, ZHANG H S, HU H X, et al. Analysis of Nsp2 expression in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infected cells[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2013, 44(7)：1109-1116. (in Chinese with English abstract)

[7] WANG F X, WEN Y J, YANG B C, et al. Role of non- structural protein 2 in the regulation of the replication of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in MARC- 145 cells: effect of gene silencing and over expression[J].VeterinaryMicrobiology, 2012, 161(1/2)：58-65.

[8] KAPPES M A, MILLER C L, FAABERG K S. Highly divergent strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus incorporate multiple isoforms of nonstructural protein 2 into virions[J].JournalofVirology, 2013, 87(24)：13456-13465.

[9] FANG Y, KIM D Y, ROPP S, et al. Heterogeneity in Nsp2 of European- like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated in the United States[J].VirusResearch, 2004, 100(2)：229-235.

[10] LIU J K, WEI C H, YANG X Y, et al. Genetic diversity and evolutionary characterization of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses based on NSP2 and ORF5[J].ArchivesofVirology, 2013, 158(8)：1811-1816.

[11] 童光志, 周艷君, 郝曉芳, 等. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2007, 29(5)：323-327.

TONG G Z, ZHOU Y J, HAO X F, et al. Identification and molecular epidemiology of the very virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in China[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine, 2007, 29(5)：323-327. (in Chinese with English abstract)

[12] HAN J, WANG Y, FAABERG K S. Complete genome analysis of RFLP 184 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].VirusResearch, 2007, 122(1/2)：175-182.

[13] BROCKMEIER S L, LOVING C L, VORWALD A C, et al. Genomic sequence and virulence comparison of four Type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains[J].VirusResearch, 2012, 169(1)：212-221.

[14] CHOI H W, NAM E, LEE Y J, et al. Genomic analysis and pathogenic characteristics of Type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp2 deletion strains isolated in Korea[J].VeterinaryMicrobiology, 2014, 170(3/4)：232-245.

[15] 毛汐語, 周遠(yuǎn)成, 趙軍, 等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒四川株的分離鑒定及Nsp2生物信息學(xué)分析[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2016(12)：1497-1504.

MAO X Y, ZHOU Y C, ZHAO J, et al. Identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains from Sichuan and Nsp2 bioinformatics analysis[J].ChineseVeterinaryScience, 2016(12)：1497-1504. (in Chinese with English abstract)

[16] GAO Z Q, GUO X, YANG H C. Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus[J].ArchivesofVirology, 2004, 149(7)：1341-1351.

[17] LIU J K, WEI C H, DAI A L, et al. Complete genomic characterization of two European- genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in Fujian province of China[J].ArchivesofVirology, 2017, 162(3)：823-833.

[18] LIU J K, ZHOU X, ZHAI J Q, et al. Emergence of a novel highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J].Transboundary&EmergingDiseases, 2017, 64(6):2059-2074.

[19] JI G, LI Y, TAN F, et al. Complete genome sequence of a Chinese highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus that has a further deletion in the Nsp2 gene[J].GenomeAnnouncements, 2016, 4(1)：e01770-e01715.

[20] 劉建奎, 魏春華, 楊小燕, 等. 福建地區(qū)PRRSV分離株Nsp2基因新變異序列鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 35(4)： 271-275.

LIU J K, WEI C H, YANG X Y, et al. Genetic variation of Nsp2 genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolated in Fujian province[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine, 2013,35(4):271-275. (in Chinese with English abstract)

[21] SHEN J, YAN X, DONG J, et al. Complete genome sequence of a novel deletion porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain[J].GenomeAnnouncements, 2013, 1(4)：e00486.

[22] ZHOU L, ZHANG J, ZENG J, et al. The 30- amino- acid deletion in the Nsp2 of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China is not related to its virulence[J].JournalofVirology, 2009, 83(10)：5156-5167.

[23] LI Y, ZHOU L, ZHANG J, et al. Nsp9 and Nsp10 contribute to the fatal virulence of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China[J].PLoSPathogens, 2014, 10(7)：e1004216.

[24] MUSIC N, GAGNON C A. The role of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus structural and non- structural proteins in virus pathogenesis[J].AnimalHealthResearchReviews, 2010, 11(2)：135-163.

[25] 王鳳雪, 劉準(zhǔn), 溫永俊, 等. 表達(dá)PRRSV強(qiáng)弱毒Nsp2的Marc- 145細(xì)胞系的建立及Nsp2蛋白對PRRSV復(fù)制的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 21(3)：1-6.

WANG F X, LIU Z, WEN Y J, et al. The construction of Marc- 145 cell lines expressing Nsp2 gene of PRRSV and Nsp2 protein effect on PRRSV replication[J].ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica, 2012, 21(3)：1-6. (in Chinese with English abstract)

[26] XING L, BAI J, WANG H, et al. Effect of amino acids residues 323- 433 and 628- 747 in Nsp2 of representative porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains on inflammatory responseinvitro[J].VirusResearch, 2015, 208:13-21.

[27] LIU Y, WANG F X, WEN Y J, et al. Effect of nonstructural protein 2 hypervariable regions in the replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Marc- 145 Cells[J].Intervirology, 2015, 58(5)：288-296.

[28] KIM D Y, CALVERT J G, CHANG K O, et al. Expression and stability of foreign tags inserted into nsp2 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)[J].VirusResearch, 2007, 128(1/2)：106-114.

[29] HAN J, RUTHERFORD M S, FAABERG K S. The porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp2 cysteine protease domain possesses both trans- and cis- cleavage activities[J].JournalofVirology, 2009, 83(18)：9449-9463.

[30] WANG L, ZHOU L, ZHANG H, et al. Interactome profile of the host cellular proteins and the nonstructural protein 2 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].PLoSOne, 2014, 9(6)：e99176.

[31] XIAO Y, WU W, GAO J, et al. Characterization of the interactome of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 2 reveals the hyper variable region as a binding platform for association with 14- 3- 3 proteins[J].JournalofProteomeResearch, 2015, 15(5)：1388-1401.

[32] 王麗. PRRSV Nsp2與宿主細(xì)胞蛋白BAG6和AIF1相互作用的分子機(jī)制[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

WANG L. Molecular mechanisms of the interaction of PRRSV Nsp2 with host cellular proteins BAG6 and AIF1 [D]. Beijing: China Agricultural University, 2014.

[33] LI N, YANG Y, ZHANG A, et al. MicroRNA- like viral small RNA from porcine reproductive and respiratory syndrome virus negatively regulates viral replication by targeting the viral nonstructural protein 2[J].Oncotarget, 2016, 7(50)：82902-82920.

[34] 馬玲, 李廣興, 洪琴, 等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒HH08株NSP2蛋白多克隆抗體的制備及其生物學(xué)功能的研究[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2013(4)：377-383.

MA L, LI G X, HONG Q, et al. Preparation and biological function of polyclonal antibodies against NSP2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus HH08 strain[J].ChineseVeterinaryScience, 2013(4)：377-383. (in Chinese with English abstract)

[35] BEURA L K, SARKAR S N, KWON B J, et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 1β modulates host innate immune response by antagonizing IRF3 activation[J].JournalofVirology, 2010, 84(3)：1574-1584.

[36] LI H, ZHENG Z, ZHOU P, et al. The cysteine protease domain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus non- structural protein 2 antagonizes interferon regulatory factor 3 activation[J].JournalofGeneralVirology, 2010, 91(12)：2947-2958.

[37] SUN Z, CHEN Z H, LAWSON S R, et al. The cysteine protease domain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 2 possesses deubiquitinating and interferon antagonism functions[J].JournalofVirology, 2010, 84(15)：7832-7846.

[38] FANG Y, FANG L, WANG Y, et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 2 contributes to NF- κB activation[J].VirologyJournal, 2012, 9(1)：1-10.

[39] BURGARA- ESTRELLA A, DIAZ I, RODRGUEZGMEZ I M, et al. Predicted peptides from non- structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus are able to induce IFN- γ and IL- 10[J].Viruses, 2013, 5(2)：663-677.

[40] YOSHII M, OKINAGA T, MIYAZAKI A, et al. Genetic polymorphism of the nsp2 gene in North American type- porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].ArchivesofVirology, 2008, 153(7)：1323-1334.

[41] KIM D Y, KAISER T J, HORLEN K, et al. Insertion and deletion in a non- essential region of the nonstructural protein 2 (nsp2) of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: effects on virulence and immunogenicity[J].VirusGenes, 2009, 38(1)：118-128.

[42] XU Y Z, ZHOU Y J, ZHANG S R, et al. Stable expression of foreign gene in nonessential region of nonstructural protein 2 (nsp2) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: applications for marker vaccine design[J].VeterinaryMicrobiology, 2012, 159(1/2)：1-10.

[43] YU L, ZHOU Y, JIANG Y, et al. Construction and in vitro evaluation of a recombinant live attenuated PRRSV expressing GM- CSF[J].VirologyJournal, 2014, 11(1)：201.