3,4,5-三甲氧基苯甲酸含量測定方法的研究

徐 曼， 汪詠梅， 張亮亮， 胡新宇

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué) 工程重點開放性實驗室；江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點實驗室， 江蘇 南京 210042)

3,4,5-三甲氧基苯甲酸是我國林產(chǎn)資源五倍子單寧深加工得到的精細(xì)化工產(chǎn)品，是一種重要的有機中間體助劑，可以進一步合成多種沒食子酸的甲基化衍生物，如3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯、 3,4,5-三甲氧基苯甲酰肼、 3,4,5-三甲氧基苯甲醛、 3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯和3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺等[1]。在醫(yī)藥方面， 3,4,5-三甲氧基苯甲酸是胃藥、抗焦慮藥、退熱藥、治療精神分裂癥藥、抗菌增效藥的重要中間體[2],可用于生產(chǎn)抗菌增效藥甲氧芐啶、抗焦慮藥三甲氧啉。現(xiàn)在有研究嘗試?yán)?,4,5-三甲氧基苯甲酸合成植物抗毒素[3]、心臟病治療藥物[4]、防曬化妝品紫外吸收劑[5]等。3,4,5-三甲氧基苯甲酸的合成方法有酯水解法、醛氧化法和甲基化法等[6-8]。其中，甲基化法是報道較早也是較為常用的合成方法。由于目前在工業(yè)生產(chǎn)中，沒有制定關(guān)于3,4,5-三甲氧基苯甲酸的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)、貿(mào)易企業(yè)在檢驗產(chǎn)品時多依據(jù)各自的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，市場處于無規(guī)范狀態(tài)，尤其是其含量的測定會因方法的不同導(dǎo)致數(shù)據(jù)有差異，所以需要對3,4,5-三甲氧基苯甲酸含量測定制定統(tǒng)一的方法標(biāo)準(zhǔn)。本研究分別采用高效液相色譜法和化學(xué)滴定法對工業(yè)生產(chǎn)的3,4,5-三甲氧基苯甲酸試樣進行測定，并對測定結(jié)果進行統(tǒng)計分析，以判斷和評價2種方法的準(zhǔn)確性和實用性，以期為生產(chǎn)、貿(mào)易企業(yè)提供可靠的測定方法。

1 實 驗

1.1材料與儀器

3,4,5-三甲氧基苯甲酸，由湖北竹山林產(chǎn)化工有限公司提供；3,4,5-三甲氧基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所提供，純度為99.13 %。色譜甲醇，進口；氫氧化鈉、甲醇、乙醇、磷酸、酚酞均為國產(chǎn)分析純。LC-20AB型高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.23,4,5-三甲氧基苯甲酸測定方法

1.2.1高效液相色譜法 測定條件：色譜柱為Kromasil C18柱(?4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(體積比60∶40，水中含體積分?jǐn)?shù)0.1 %的磷酸，下同)；測試液質(zhì)量濃度2 g/L(溶于甲醇)；進樣量10 μL；流速1 mL/min；UV檢測器波長256 nm。稱取3,4,5-三甲氧基苯甲酸試樣和標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 g(精確至0.000 1 g)，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇使其溶解。分別配置10個供測試樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。得到色譜峰面積響應(yīng)值，以樣品溶液峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積比較定量。另外，用3,4,5-三甲氧基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品配置不同質(zhì)量濃度(12.5、 25.0、 50.0、 100.0、 200.0和400.0 mg/L)的供試液。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=25 309x-78 577，R2=0.997 8。

3,4,5-三甲氧基苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X1，%)，按下式計算：

式中：S1—試樣溶液峰面積值；S2—標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液峰面積值；m1—3,4,5-三甲氧基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量，g；p—3,4,5-三甲氧基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)樣品純度，%；m0—試樣質(zhì)量，g。

1.2.2化學(xué)滴定法 準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥的試樣約0.200 g(精確至0.000 1 g)，置于250 mL錐形瓶中，加入25 mL中性乙醇溶液溶解，滴加1～2滴酚酞指示液，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度0.100 1 mol/L)滴定至淡紅色出現(xiàn)并保持30秒不褪色為終點。

3,4,5-三甲氧基苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2，%)，按下式計算：

式中：c—氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V—試樣消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；m—3,4,5-三甲氧基苯甲酸試樣質(zhì)量，g；M—每毫摩爾3,4,5-三甲氧基苯甲酸的質(zhì)量，0.212 2 g/mmol。

1.32種方法準(zhǔn)確性檢驗

稱取6份經(jīng)干燥的試樣, 分別加入一定量3,4,5-三甲氧基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照1.2.1節(jié)方法操作，使用峰面積和質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算高效液相色譜法的加標(biāo)回收率。另稱取6份干燥的標(biāo)準(zhǔn)樣品，按1.2.2節(jié)條件操作，計算實際消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積與理論消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積比值(R)，探討化學(xué)滴定法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與討論

2.1采用高效液相色譜法測定3,4,5-三甲氧基苯甲酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖1為通過高效液相色譜法測定的3,4,5-三甲氧基苯甲酸測試樣品色譜圖。

對同一3,4,5-三甲氧基苯甲酸試樣共測得10個供試樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的獨立測值(%)，將測定數(shù)據(jù)匯總，按數(shù)值從小到大排列為： 98.72、 98.80、 98.86、 98.98、 99.62、 99.79、 99.86、 100.03、 100.08、 100.34。

查表得：n=10，α=0.01，G0.01=2.482；n=10，α=0.05，G0.05=2.290。

圖 1 3,4,5-三甲氧基苯甲酸色譜圖

用Grubbs檢驗最大值和最小值是否為異常值，取檢出水平α=0.05。將計算的統(tǒng)計測定值(G)與臨界值(G0.05)[9]比較決定舍棄或保留：G>G0.05者舍棄，G

表1 高效液相色譜法測定值的Grubbs檢驗(α=0.05)

在進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和分析時，要基于該數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，因此要對原始數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗。用偏態(tài)系數(shù)和峰態(tài)系數(shù)檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)性，偏態(tài)系數(shù)(A)用于檢驗數(shù)據(jù)的不對稱性，峰態(tài)系數(shù)(B)用于檢驗數(shù)據(jù)的峰態(tài)。通過比較計算得到的數(shù)值，如果A小于相應(yīng)的臨界值，B處于臨界區(qū)間B～B′中，則可以說明數(shù)據(jù)是服從正態(tài)分布的[10]。

2.2采用化學(xué)滴定法測定3,4,5-三甲氧基苯甲酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

對同一3,4,5-三甲氧基苯甲酸試樣共測得10個供試樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的獨立測值(%)，將測定數(shù)據(jù)匯總，按數(shù)值從小到大排列：98.82、 98.97、 99.34、 99.57、 99.78、 99.82、 100.09、 100.26、 100.35、 100.99。

查表得：n=10，α=0.01，G0.01=2.482；n=10，α=0.05，G0.05=2.290。

用Grubbs檢驗可疑界外值，取檢出水平α=0.05，將計算的統(tǒng)計測定值(G)與表列臨界值(G0.05)[9]比較決定舍棄或保留：G>G0.05者舍棄，G

表 2 化學(xué)滴定法測定值的Grubbs檢驗(α = 0.05)

計算偏態(tài)系數(shù)(A)和峰態(tài)系數(shù)(B)，檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性[10]：

2.32種方法的準(zhǔn)確性測定

對2種方法測定值進行計算，高效液相色譜法利用色譜峰面積與樣品質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的加標(biāo)回收率計算結(jié)果見表3，化學(xué)滴定法測定計算結(jié)果見表4。高效液相色譜法的平均回收率為99.30 %，化學(xué)滴定法的R值為99.35 %，2種方法都可以對供試樣品含量進行有效的測定分析。

表3高效液相色譜法加標(biāo)回收率測定結(jié)果

Table3StandardadditionrecoveryofHPLCmethod

編號No．樣品質(zhì)量濃度/(g·L-1)samplecontent對照品加入量/gstandardsubstanceaddition測量值/(g·L-1)measuredvalue回收率/%recoveryrate10．2010．02200．41698．9320．1980．01950．39199．4030．1990．02020．40199．1340．1970．01990．39098．5250．2000．02040．40299．5160．1970．02030．401100．32平均值average99．30

表4化學(xué)滴定法測定結(jié)果

Table4Resultoftitrationmethod

編號No．標(biāo)準(zhǔn)樣品加入量/gsampleaddition理論消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積值/mLtheoreticalvolumevalueofNaOHstandardsolution實際消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積值/mLactualvolumevalueofNaOHstandardsolution體積比值/%volumeratio10．11625．47055．396．8820．10114．75964．798．7530．10234．81614．899．6740．10184．79264．8100．1650．10755．06095．098．8060．10434．91035．0101．83平均值average99．35

2.4對2種測定方法的測定值進行t檢驗

由2.1和2.2節(jié)可知，2種方法的測定值都服從正態(tài)分布，測定誤差屬于隨機誤差，用t檢驗考察2種方法測定值的差異是否顯著[9]。

將測定值代入上式得到：

t=99.51-99.80/0.2840=1.021

對于自由度=10+10-2=18，查t分布置信系數(shù)表得：t0.05(18)=2.10。

t的計算值1.021小于臨界值2.10，表明2種方法的平均值之間無顯著性差異。

2.5對2種測定方法測定值的準(zhǔn)確性與實用性評價

高效液相色譜是一種重要的分析手段，它利用物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的微小差異，當(dāng)兩相做相對移動時，使被測物質(zhì)在兩相之間進行反復(fù)多次分配，這樣使原來微小的分配差異產(chǎn)生了很大分離的效果，使組分分離?；瘜W(xué)滴定法是根據(jù)已知濃度的試劑溶液和被測物質(zhì)完全反應(yīng)時所消耗的體積及其濃度來計算被測物質(zhì)的含量，化學(xué)滴定法應(yīng)用范圍廣，具有操作簡單、試劑易得、成本低、分析準(zhǔn)確度較高等優(yōu)點。

本研究主要目的是比較3,4,5-三甲氧基苯甲酸含量測定的方法，通過前期調(diào)研和預(yù)實驗，選擇目前企業(yè)使用的高效液相色譜法和化學(xué)滴定法來進行比較實驗。對2種測定方法的測定值分別進行了Grubbs檢驗、正態(tài)檢驗、均數(shù)比較(t檢驗)。從正態(tài)檢驗結(jié)果看，2種測定方法的測定值都呈現(xiàn)正態(tài)性，表明其測定誤差屬隨機誤差。進一步通過t檢驗來判別2種方法的測定值之間是否存在顯著差異，結(jié)果表明2種方法測得的含量平均值無顯著性差異，所以2種方法在測定時都是可用的。比較2種方法的測定值，化學(xué)滴定法測得的平均值為99.80%略高于高效液相色譜法的99.51 %，而3,4,5-三甲氧基苯甲酸是由沒食子酸轉(zhuǎn)化得到，假設(shè)產(chǎn)品中有微量的沒食子酸殘留的雜質(zhì)，在化學(xué)滴定法中氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的消耗會增加，會導(dǎo)致測定值偏高。高效液相色譜法具有高分辨率和靈敏度，可以分辨出存在的雜質(zhì)，而且選擇性好、分離度好、分析用量較少、保留時間短、耗費溶劑量少。化學(xué)滴定法樣品需求量較大，而且化學(xué)滴定法在實際操作中和檢驗人員的經(jīng)驗也有很大關(guān)系，對測量數(shù)據(jù)會有一定影響。因此，高效液相色譜法的測定值有更高的準(zhǔn)確度和精密度，在工業(yè)生產(chǎn)分析中會發(fā)揮更大的作用。

3 結(jié) 論

3.1研究了采用高效液相色譜法和化學(xué)滴定法測定3,4,5-三甲氧基苯甲酸含量的測定方法，提出了2種測定方法的實驗條件。檢驗數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計分析表明，2種方法的測定數(shù)據(jù)均遵從正態(tài)分布，測量誤差屬于隨機誤差，因此，2種測定方法均具有實用性。

3.2進行了高效液相色譜法和化學(xué)滴定法測定3,4,5-三甲氧基苯甲酸含量值的均數(shù)測定比較，檢驗結(jié)果表明2種測定方法的精密度無顯著性差異。

3.3高效液相色譜法測定平均值99.51 %，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.608 %；化學(xué)滴定法測定平均值99.80 %，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.661 %。高效液相色譜法的測定值有更高的準(zhǔn)確度和精密度，建議在制定3,4,5-三甲氧基苯甲酸相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)時，含量檢測的統(tǒng)一方法選擇高效液相色譜法，在不具備色譜儀的情況下也可使用化學(xué)滴定法。

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