檸檬酸發(fā)酵廢渣及食用菌渣復配基質(zhì)二次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)氨基葡萄糖工藝

丁振中，馮小海，張超，雷鵬，史勁松，李恒

（1.揚州日興生物科技股份有限公司，江蘇揚州 225601；2.江南大學，江蘇無錫 214122）

氨基葡萄糖簡稱氨糖，化學名稱為2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，其作為營養(yǎng)品和藥品具有廣泛的應(yīng)用，是骨關(guān)節(jié)炎的膳食補充劑和臨床治療的輔助用藥，能夠強化軟骨結(jié)構(gòu)，預防關(guān)節(jié)病變，修復骨質(zhì)疏松導致的軟骨受損，舒緩關(guān)節(jié)炎引起的疼痛、僵硬和腫脹[1]。隨著世界范圍內(nèi)人口結(jié)構(gòu)的老齡化，骨關(guān)節(jié)炎患者越來越多，氨糖作為膳食補充劑被大量用于骨關(guān)節(jié)炎的預防和輔助治療，全球氨糖市場已發(fā)展到3萬噸的規(guī)模，制品產(chǎn)業(yè)鏈總產(chǎn)值在40億美元左右，具有廣闊的市場前景[2]。

然而，隨著氨糖市場的快速發(fā)展，其產(chǎn)品品質(zhì)和原料來源問題逐漸突出。目前，市場上的氨糖主要為甲殼源氨糖，是以蝦蟹殼為原料，通過脫脂、去鈣等步驟進行生產(chǎn)，雖然產(chǎn)品純度能夠滿足醫(yī)藥和食品標準，但仍存在微量過敏因子，易引發(fā)皮疹、騷癢、過敏性哮喘等癥狀[3-4]。近年來，國際市場上產(chǎn)生了安全性更好的植物源氨糖，其原料不是來自動物甲殼素，而是來自植物原料轉(zhuǎn)化而成的真菌幾丁質(zhì)[5]。

本研究采用工業(yè)發(fā)酵檸檬酸的廢棄玉米渣（含菌絲體）和食用菌工廠化栽培產(chǎn)生的大量菌根、菌渣為原料生產(chǎn)植物源氨糖。研究創(chuàng)新的使用生物轉(zhuǎn)化富集技術(shù)，通過對基料進行組分調(diào)整，再接種綠色木霉進行生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高原料幾丁質(zhì)含量；同時，首次使用物理場輔助催化技術(shù)，采用超聲波-酸解聯(lián)用技術(shù)，減少酸堿用量，提高水解度。

1 材料與方法

1.1 菌種

綠色木霉（Trichoderma viride），由揚州日興生物科技股份有限公司研發(fā)部自主分離并保藏于公司研發(fā)中心，本研究所用菌劑為揚州日興生物科技股份有限公司自主制備的綠色木霉粉劑，有效活菌數(shù)≥109/g。

1.2 廢棄物基質(zhì)來源

工業(yè)發(fā)酵檸檬酸的廢棄玉米渣（含菌絲體），食用菌生產(chǎn)菌渣。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

玉米渣，食用菌渣，玉米粉，(NH4)2SO4，KH2PO4，吐溫80。

1.4 發(fā)酵工藝

將玉米渣、食用菌渣按一定比例混合為復配基質(zhì)，然后再向復配基質(zhì)中加入玉米粉12%、(NH4)2SO42.5%、KH2PO41.5%、吐溫80 0.5%，加入適量的水，攪拌均勻后進行滅菌處理，冷卻后拌入2.5%的綠色木霉粉劑。拌料均勻后淺盤發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為48 h。

1.5 發(fā)酵基質(zhì)中氨基葡萄糖含量檢測

氨基葡萄糖的提取按照Guerriero等人的方法[6]。稱取1 g發(fā)酵前或發(fā)酵后基質(zhì)，在研缽內(nèi)用液氮研磨成粉末，然后懸浮于2mL去離子水中，13 000 g離心10 min，棄上清，將沉淀在冷凍干燥機中過夜凍干。稱取凍干后的粉末5 mg，加入1mL 6mmol HCl，置于100℃水浴中4 h，隨后冷卻至室溫，吸取0.2mL測定氨基葡萄糖含量。

氨基葡萄糖按照Morgan-Elson方法檢測[7]。取0.2mL待測液加入乙酰丙酮試劑1.0mL，90℃水浴1 h，冷卻至室溫，慢慢加入10mL 96%乙醇，然后加入DMAB試劑1.0mL，混合均勻。混合后室溫放置1 h，530 nm處比色，根據(jù)標準曲線計算胞內(nèi)氨基葡萄糖的產(chǎn)量。

乙酰丙酮試劑配制：1.5mL乙酰丙酮，溶于50mL 1.25 mol/L碳酸鈉溶液中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

DMAB試劑配制：1.6 g對二甲氨基苯甲醛（DMAB）溶于30mL濃鹽酸和30mL 96%的乙醇中，-4℃保存。

1.6 氨基葡萄糖粗提液制備

將發(fā)酵后的菌絲體復合物置于真空冷凍干燥機中，設(shè)置真空度為-2 MPa，溫度為-10℃，真空冷凍處理24 h。然后向發(fā)酵菌絲體復合物中加入0.2 mmol 20%醋酸溶液，攪拌30 min后置于超聲儀中，設(shè)置超聲功率為60 W、溫度為40℃、時間為20 min，抽濾即可得到含有氨基葡萄糖的粗提取液。按照1.5中的Morgan-Elson方法測定粗提液中氨基葡萄糖含量，并計算氨基葡萄糖提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米渣、食用菌渣復配比例對發(fā)酵氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響

真菌中氨基葡萄糖主要來自于細胞壁幾丁質(zhì)的水解。如圖1所示，玉米渣與食用菌渣復配時，較高的玉米渣含量有利于綠色木霉菌的生長，從而提高菌絲體中幾丁質(zhì)的含量。當玉米渣-食用菌渣配比2∶1時，最有利于菌體生長產(chǎn)生幾丁質(zhì)，因而氨基葡萄糖含量最高。較低的玉米渣配比則不利于菌體生長。檸檬酸發(fā)酵玉米渣中，總糖含量高達35%以上[8]，且以易被生物利用的淀粉為主，在發(fā)酵過程中，玉米渣作為主要碳源給菌體生長提供必要的能量，因此，玉米渣含量較高時有利于菌體的生長。而食用菌菌渣中主要營養(yǎng)成分為粗蛋白，在發(fā)酵過程中為綠色木霉提供氮源，此外食用菌菌渣還富含微量元素，在高配比時，過多的微量元素不利于綠色木霉的生長[9]。

圖1 玉米渣-食用菌渣配比對綠色木霉產(chǎn)氨基葡萄糖的影響

2.2 初始含水量對綠色木霉發(fā)酵氨基葡萄糖的影響

本研究考察了初始含水量為45%、50%、55%、60%、65%和70%時，綠色木霉發(fā)酵產(chǎn)氨基葡萄糖（幾丁質(zhì)水解）的規(guī)律，如圖2所示。含水量較低時，不利于綠色木霉菌絲體的生長，隨著含水量的增加，菌絲體生長加快，幾丁質(zhì)含量增加，氨基葡萄糖產(chǎn)率高，當含水量為60%時，氨基葡萄糖含量達到最高15.1%，繼續(xù)增加培養(yǎng)基水分含量則會降低菌體生長。水分含量是綠色木霉固態(tài)發(fā)酵中的重要參數(shù)，水分含量過高，會造成固體物料結(jié)塊，導致孔隙度降低，響固態(tài)過程中的氧的傳遞和熱量的交換；而水分不足則會造成營養(yǎng)物質(zhì)的不充分利用，引起微生物生長緩慢、目標產(chǎn)物合成效率較低[10]。

圖2 含水量對綠色木霉固態(tài)發(fā)酵氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響

2.3 玉米渣-食用菌渣復配基質(zhì)處理前后氨基葡萄糖含量對比

本研究對比了玉米渣-食用菌渣復配基質(zhì)（復配比為2∶1）在用綠色木霉發(fā)酵前后氨基葡萄糖的含量變化。如圖3所示，發(fā)酵前，復配基質(zhì)中的氨基葡萄糖含量僅為5.7%，經(jīng)綠色木霉生物轉(zhuǎn)化后，復配基質(zhì)中的氨基葡萄糖含量達到15.4%，氨基葡萄糖含量提高了9.7%，這說明使用綠色木霉確實能夠轉(zhuǎn)化檸檬酸發(fā)酵玉米渣及食用菌渣這些工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物，使其變廢為寶，成為具有工業(yè)化前景的氨基葡萄糖來源。

圖3 發(fā)酵前后玉米渣-食用菌渣復配基質(zhì)中氨基葡萄糖含量變化

2.4 超聲-酸解聯(lián)合制備氨基葡萄糖粗提液工藝優(yōu)化

本研究考察了超聲時間為60 min，超聲溫度為80℃時，不同超聲功率對提取液中氨基葡萄糖得率的影響，結(jié)果見表1。隨著超聲功率的增大，粗提液中氨基葡萄糖得率增加，當超聲功率在60～80 W時，粗提液中氨基葡萄糖得率變化不大，從經(jīng)濟生產(chǎn)的角度考慮，以60 W作為最佳提取功率。

表1 超聲功率對粗提液中氨基葡萄糖得率的影響

考察在超聲功率為60 W，超聲溫度為80℃時，超聲時間對粗提液中氨基葡萄糖得率的影響，結(jié)果見表2。隨著超聲時間的增加，綠色木霉菌絲體中的幾丁質(zhì)逐漸釋放到溶液中，并且在酸環(huán)境中水解為氨基葡萄糖，超聲時間越長，粗提液中氨基葡萄糖得率越高，當超聲時間為40～60 min時，粗提液中的氨基葡萄糖得率達到最高值，且變化不再顯著。因此，從經(jīng)濟生產(chǎn)的角度考慮，本研究采用40 min作為最佳超聲時間。

表2 超聲時間對粗提液中氨基葡萄糖得率的影響

考察在超聲功率為60 W，超聲時間為40 min時，超聲溫度對粗提液中氨基葡萄糖得率的影響，結(jié)果見表3。隨著溫度的提高，菌絲體上的幾丁質(zhì)釋放量及水解程度增加，粗提液中的氨基葡萄糖含量增加。當溫度達到60℃以上后，粗提液中氨基葡萄糖得率最高，且不再隨溫度升高有顯著變化。從節(jié)能生產(chǎn)的角度考慮，確定最佳的超聲提取溫度為60℃。

表3 超聲溫度對粗提液中氨基葡萄糖得率的影響

采用物理場輔助催化技術(shù)，可簡化幾丁質(zhì)分離和降解過程，使酸堿耗量大幅度降低，并使資源化利用成為可能。本研究利用超聲波的空化效應(yīng)，使菌絲體表面破碎，有利于菌絲體細胞壁充分剝離。由于幾丁質(zhì)主要存在于細胞壁中，后續(xù)的酸解僅對分離出的細胞壁進行，而避免同時水解其他有機質(zhì)，該項技術(shù)可以大幅度減少后續(xù)的酸堿耗量[11]。

3 結(jié)論

本研究創(chuàng)新性的使用生物轉(zhuǎn)化富集技術(shù)，通過對工農(nóng)業(yè)廢棄基料進行組分調(diào)整和預處理，再接種綠色木霉利用淺盤固態(tài)發(fā)酵法進行二次生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，確立了最佳的玉米渣-菌渣復配比（2∶1）和發(fā)酵初始含水量（60%），使原料氨基葡萄糖（幾丁質(zhì)水解）含量提高了9.7%，突破了原料幾丁質(zhì)含量低導致的高成本瓶頸。此外，本研究首次使用物理場輔助催化技術(shù)，采用超聲波-酸解聯(lián)用技術(shù)，確立了最佳超聲強度（60 W）、最佳超聲時間（40 min）和最佳超聲溫度（60℃），減少了酸堿用量，提高水解度，解決了幾丁質(zhì)分離降解過程中酸用量大的問題，使粗提液中氨基葡萄糖得率達到90%以上。本技術(shù)可再生利用工業(yè)發(fā)酵檸檬酸的廢棄玉米渣（含菌絲體）和食用菌工廠化栽培產(chǎn)生的大量菌根、菌渣，實現(xiàn)了大宗廢棄物的資源化和高值化利用，對農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收和產(chǎn)業(yè)環(huán)境的改善具有重要意義。

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