基于缺氧誘導(dǎo)因子及PI3K-AKT-mTOR信號通路誘導(dǎo)佐劑關(guān)節(jié)炎滑膜血管新生的實(shí)驗(yàn)觀察

張曉軍，劉健，萬磊，黃傳兵，黃旦，齊亞軍

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)炎癥會(huì)造成關(guān)節(jié)變形、甚至殘廢，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。RA病理本質(zhì)為血管炎和滑膜炎[1]。滑膜炎和血管炎的形成過程受多種因素調(diào)節(jié)，其中滑膜血管新生的形成與RA病理表現(xiàn)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)新生血管生成不僅是維持滑膜細(xì)胞增生的必要條件，而且與滑膜炎癥程度有關(guān)[2]。RA滑膜血管新生機(jī)制復(fù)雜，近年來，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路和缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF-1α)表達(dá)失衡成為研究的熱點(diǎn)[3]。HIF-1α是缺氧狀態(tài)下滑膜血管生成的核心調(diào)控因子，HIF-1α可以通過合成一氧化氮使血管舒張，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-Α)表達(dá)使滑膜血管通透性增加。而VEGF-Α可以通過血小板衍生生長因子等一系列作用，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增生，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而形成加重滑膜血管新生形成[4]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶向蛋白(mTOR)是HIF-1α的正性調(diào)節(jié)因子。PI3K-AKT-mTOR信號通路可以導(dǎo)致HIF-1a含量增加，進(jìn)而促進(jìn)滑膜血管新生形成。筆者通過弗氏完全佐劑(FCA)復(fù)制佐劑關(guān)節(jié)炎(AA) 大鼠模型，通過觀察AA大鼠滑膜血管新生表現(xiàn)，檢測滑膜血管PI3K-AKT-mTOR通路及HIF-1α表達(dá)，并分析PI3K-AKT-mTOR信號通路、HIF-1α與滑膜血管新生的關(guān)系，探討RA滑膜血管新生的原因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大鼠：SD大鼠，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院和基礎(chǔ)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)審核通過，清潔級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

1.2 試劑 FCA：Sigma，USA,批號：116K8706；HIF-1α:Bioworld公司，USA,批號：22061046-1；VEGF-A試劑盒：美國santa cruz生物技術(shù)公司，批號：sc-507；VEGF-A試劑盒：圣塔克魯茲公司，USA，批號：sc-1045；MVD試劑盒：圣塔克魯茲公司，USA，批號：sc-376975；白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)試劑盒： RD公司，USA,批號：2013012205、2012100204。羊抗PI3K、鼠抗AKT1、兔抗p- AKT1、兔抗mTOR抗體：圣塔克魯茲公司，USA，批號： sc-48637、sc-5298、sc-135650、sc-8319；兔抗內(nèi)皮抑素(ES):abcam公司，USA,批號：ab01387。

1.3 儀器與設(shè)備 病理切片機(jī)： LEICA，德國,型號：2235；顯微攝像系統(tǒng)：OLYMPUS,日本，型號:BX51T-32000-2；高速冷凍離心機(jī)：Sigma，德國，型號：2-16PK。電泳儀：美國Amersham公司,型號：EPS-301；凝膠圖像分析儀：美國Bio-RAD公司，型號：Gel Doc XR。

1.4 方法

1.4.1 模型制備與分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只將大鼠均分為正常組和模型組。向模型組大鼠注射FCA 0.1mL致炎,復(fù)制成 AA大鼠模型[5]，致炎后第19天開始檢測指標(biāo)。

1.4.2 血清HIF-1α、VEGF-A、IL-6、IL-10表達(dá)的檢測 采用ELISA法檢測大鼠血清MVD、HIF-1α、VEGF-A。具體步驟依照試劑盒操作。

1.4.3 滑膜MVD測定 將各組大鼠無菌取雙膝關(guān)節(jié)滑膜，常規(guī)制備石蠟包埋切片，行SABC法染色。采用山羊抗鼠MVD多克隆抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞(一抗?jié)舛认♂尡壤?∶200)，顯微鏡下觀察各組血管新生情況。在×100倍的視野下計(jì)數(shù)3個(gè)微血管密集區(qū)的微血管數(shù)，取其平均值表示MVD[6]。

1.4.4 滑膜PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白檢測 制備滑膜組織蛋白樣品，取15 μg總蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉、孵育PI3K、AKT、p-AKT、mTOR一抗2 h，分別采用抗羊、小鼠、兔二抗孵育1 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光，沖洗，用掃描儀對膠片進(jìn)行掃描、攝像；采用圖像分析軟件對條帶進(jìn)行分析處理，計(jì)算各組條帶的灰度值，以條帶與各組內(nèi)參β-actin灰度值的比值做為滑膜PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白的表達(dá)量[7]。

2 結(jié)果

2.1 足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化 關(guān)節(jié)炎模型復(fù)制前，兩組大鼠關(guān)節(jié)癥狀差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。致炎后，模型組關(guān)節(jié)癥狀均明顯高于正常組(P<0.01)。見表1。

表1 兩組大鼠足跖腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化

2.2 血清HIF-1α、VEGF-A、IL-6、IL-10變化 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6、HIF-1α、VEGF-A 明顯升高，IL-10 表達(dá)降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

組別鼠數(shù)(只)HIF-1αVEGFIL-6IL-10正常組1559.79±9.7865.75±9.3555.70±8.7528.29±7.89模型組1564.34±13.1298.14±12.1779.46±11.3636.43±9.57t值1.0778.1746.4182.542P值0.291<0.001<0.0010.017

2.3 大鼠滑膜血管MVD計(jì)數(shù)比較 模型組大鼠滑膜組織新生血管豐富、數(shù)量多、密集，MVD 明顯高于正常組 (P<0.01)。見圖1。

2．4 大鼠滑膜組織PI3K、AKT1、p-AKT1、mTOR蛋白表達(dá) 與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織PI3K、AKT1、p-AKT1、mTOR均升高。見圖2。

A：正常組(SP法,×200)，B：模型組(SP法,×200)，C：正常組和模型組MVD比較(與正常組比較,aP<0.01)

圖1兩組大鼠滑膜血管微血管密度變化

與正常組比較,aP<0.05，bP<0.01

圖2兩組大鼠滑膜PI3K、AKT、p-AKT、mTOR比較

2．5 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，HIF-1α與MVD、VEGF-A呈正相關(guān)，PI3K與MVD計(jì)數(shù)、 p-AKT1蛋白呈正相關(guān)，PI3K、p-AKT1與VEGF-Α、HIF-1α呈正相關(guān)，mTOR與VEGF-A、PI3K、AKT呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 兩組觀察指標(biāo)的相關(guān)性分析(r值)

注： 采用PEARSON相關(guān)性分析，aP<0.05

3 討論

PI3K/AKT信號通路激活、HIF-1α、VEGF-Α表達(dá)失衡可能是滑膜血管新生的重要因素[8]。PI3K/AKT通路是RA滑膜血管新生的重要調(diào)節(jié)因子，HIF-1α是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)VEGF-Α表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)血管形成和血管通透性增加[9-10]。PI3K /AKT通路過度激活會(huì)促使HIF-1α、VEGF-Α表達(dá)升高。PI3K/AKT通路和HIF-1α、VEGF-Α表達(dá)之間的連系點(diǎn)是mTOR。mTOR是PI3K/AKT下游底物。PI3K/AKT激活mTOR可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生長。

PI3K具有調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝、增殖、凋亡的作用。PI3K/AKT通路激活可參與組織細(xì)胞炎性反應(yīng)的增強(qiáng)，并導(dǎo)致低氧環(huán)境誘導(dǎo)的滑膜血管的分化、生長，從而發(fā)揮其介導(dǎo)參與細(xì)胞生長、發(fā)育和血管調(diào)節(jié)作用的生物學(xué)效應(yīng)。PI3K的活化而使AKT 發(fā)生磷酸化。AKT是PI3K的效應(yīng)器，P-AKT通常被認(rèn)為是PI3K激活的標(biāo)志。PI3K激活后逐漸激活A(yù)KT，活化的AKT能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡，增加細(xì)胞因子的基因表達(dá)[11]。因此，PI3K激活A(yù)KT過程中滑膜血管新生發(fā)生的重要啟動(dòng)點(diǎn)。同時(shí)，滑膜血管生成與HIF-1α、VEGF-Α表達(dá)有關(guān)。HIF-1α是VEGF-Α激活和滑膜血管新生形成的調(diào)節(jié)蛋白，HIF-1α的高表達(dá)可直接參與滑膜血管新生的形成。HIF-1α可參與滑膜炎的發(fā)生、發(fā)展過程，HIF-1α表達(dá)高低可反映關(guān)節(jié)炎癥的程度。VEGF-Α、HIF-1α在RA滑膜血管新生中起直接誘導(dǎo)作用。VEGF-Α可致血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，導(dǎo)致RA血管新生形成。PI3K/AKT通路可調(diào)節(jié)HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)VEGF-Α表達(dá)[12]。同時(shí)，VEGF-Α的分泌也受PI3K/AKT通路的調(diào)節(jié)。本研究顯示，AA大鼠滑膜血管PI3K、AKT表達(dá)升高，且PI3K、p-AKT與VEGF-Α、HIF-1α呈正相關(guān)，而VEGF-Α、HIF-1α表達(dá)隨之升高。說明AA大鼠滑膜中PI3K /AKT通路的過度激活可能會(huì)上調(diào)HIF-1α、VEGF-Α的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，促進(jìn)滑膜血管新生形成。本次研究結(jié)果與文獻(xiàn)[13-14]研究結(jié)論一致。

mTOR對滑膜細(xì)胞的增殖分化起作用?；ぱ装Y的進(jìn)一步增加會(huì)使關(guān)節(jié)腔處于缺氧的微環(huán)境中，處于缺氧狀態(tài)的滑膜細(xì)胞通過新生血管生成，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞炎性細(xì)胞不斷浸潤，惡性循環(huán)加重滑膜炎癥和關(guān)節(jié)炎程度。HIF-1α是缺氧狀態(tài)下調(diào)控關(guān)節(jié)腔微環(huán)境和滑膜血管新生的關(guān)鍵因子[15]。mTOR的激活可以明顯增加HIF-1α蛋白的合成。mTOR在PI3K /AKT通路過度激活后，可引起mTOR通路的激活，從而進(jìn)一步導(dǎo)致HIF-1α升高，加重滑膜炎癥和滑膜血管新生的形成。研究[16]顯示，mTOR能增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達(dá)，而HIF-1α表達(dá)的增加，會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)與滑膜血管新生密切相關(guān)的VEGF-Α表達(dá)，加重滑膜血管新生的形成。筆者研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA大鼠滑膜血管出現(xiàn)新生變化時(shí)，mTOR蛋白表達(dá)升高，同時(shí)，滑膜血管HIF-1a和VEGF表達(dá)升高，相關(guān)性分析亦顯示，mTOR與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)。提示mTOR、HIF-1a、VEGF-Α可能共同參與滑膜血管新生的過程。進(jìn)一步聯(lián)系PI3K/AKT蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，mTOR表達(dá)與PI3K、AKT蛋白表達(dá)呈一定相關(guān)性。這說明PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路的過度激活，可能會(huì)導(dǎo)致mTOR表達(dá)量增加，進(jìn)而刺激HIF-1a分泌升高，而HIF-1a表達(dá)升高會(huì)增強(qiáng)其下游基因VEGF-Α等的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)滑膜新生血管生成。此結(jié)果與Lin等[17]研究結(jié)論相似。研究[18]表明，mTOR可以增加HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性，增加HIF-1α蛋白表達(dá)和合成；mTOR還可促進(jìn)熱休克蛋白的表達(dá)，而熱休克蛋白不但具有刺激滑膜炎性增加的作用，還具有抑制HIF-1α蛋白的功能。

總之，根據(jù)以上研究結(jié)果，筆者推測mTOR一方面受PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)激活，一方面可以增加滑膜HIF-1α蛋白的合成或抑制其降解，使得HIF-1α蛋白水平增加，導(dǎo)致VEGF-A升高，從而通過促進(jìn)滑膜新生血管生長，參與滑膜炎癥的過程和血管病變。

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