人卵丘顆粒細(xì)胞和壁層顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)方法比較*

何 文， 呂 杰， 李 濤， 文艷飛， 韓嬋林， 蔡柳洪△

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心， 廣東 廣州 510630； 2江門市中心醫(yī)院，中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院生殖中心， 廣東 江門 529030)

卵巢顆粒細(xì)胞是組成卵泡最大的細(xì)胞群，是女性生殖過程中發(fā)揮重要作用的一類細(xì)胞。顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間存在廣泛的信息交流，二者形成功能上的統(tǒng)一體。研究表明，顆粒細(xì)胞的質(zhì)量下降或凋亡增多會(huì)影響激素和細(xì)胞因子的分泌，甚至影響卵母細(xì)胞的發(fā)育以及后續(xù)的胚胎質(zhì)量[1-2]。當(dāng)卵泡竇腔形成后，顆粒細(xì)胞分化可為卵丘顆粒細(xì)胞(cumulus cells，CCs)和壁層顆粒細(xì)胞(mural granulosa cells，MGCs)，這2種顆粒細(xì)胞在卵泡生長過程中發(fā)揮著不同的作用[3-4]。MGCs是承擔(dān)卵巢分泌激素和細(xì)胞因子的主要功能細(xì)胞，主要通過旁分泌和自分泌的形式調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育過程[5]；CCs附著于卵母細(xì)胞，與卵母細(xì)胞形成一個(gè)結(jié)構(gòu)功能緊密的合胞體，通過復(fù)雜的細(xì)胞間鏈接機(jī)制參與影響卵泡發(fā)育[6]。

人卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立，不僅可運(yùn)用于女性生殖內(nèi)分泌和輔助生殖技術(shù)的研究，而且可應(yīng)用于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的生理及藥物毒性等的研究。由于MGCs的原代培養(yǎng)樣本較易獲取，因此關(guān)于人MGCs體外建系的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但由于提取CCs需要的樣本來源較難獲得和所需樣本量大等因素限制，因此關(guān)于人CCs體外建系的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)依托中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心充足的臨床樣本，選取進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技術(shù)治療的患者，用機(jī)械切割所得卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物培養(yǎng)人CCs，并與人MGCs體外培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)比，比較2種顆粒細(xì)胞建系的操作特點(diǎn)及細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性，旨在建立人CCs體外培養(yǎng)體系，作為人顆粒細(xì)胞亞群的補(bǔ)充。

材 料 和 方 法

1材料

人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Paque PLUS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青/鏈霉素、L-谷氨肽胺(GlutaMAXTM-I)、非必需氨基酸(nonessential amino acids，NEAA)、0.25% 胰酶和PBS緩沖液均購于Invitrogen；抗人卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)抗體購于R&D Systems；MOPS緩沖液購于Vitrolife；驢抗小鼠熒光II抗購于Abcam；Triton X-100、Tris-HCl和Tween-20購于Amresco；4%多聚甲醛和正常山羊血清封閉液購于BOSTER；Hoechst 33342購于碧云天；CCK-8試劑盒購于Dojindo；雌激素檢測(cè)ELISA試劑盒購于Elabscience。

收集2016年11月～2017年4月于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心行ICSI治療的患者樣本共30例。所有患者均年齡介于25～35歲，基礎(chǔ)性激素水平在正常范圍內(nèi)，月經(jīng)第3天竇卵泡數(shù)在7～20個(gè)之間，均采用經(jīng)典黃體期長方案超排卵，獲卵數(shù)≥20個(gè)。實(shí)驗(yàn)過程所涉及卵泡液和卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物均為患者治療過程中的醫(yī)療廢物，所有樣本均獲得患者的知情同意，項(xiàng)目的實(shí)施獲得中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2方法

2.1人卵丘顆粒細(xì)胞的分離、提純及培養(yǎng) 對(duì)ICSI超排卵患者收集取卵后， 常規(guī)進(jìn)行卵母細(xì)胞-卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物機(jī)械切割處理， 所得的卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物(要求每次收集ICSI樣本獲卵數(shù)≥20個(gè))用顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基)于培養(yǎng)皿中洗滌2次， 以去除撿卵過程中的MOPS液和沖洗液中的礦物油，然后用1.5 mL顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基接種于12孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后全量換液1次，之后每48 h全量換液1 次，光學(xué)顯微鏡觀察顆粒細(xì)胞形態(tài)。

2.2人壁層顆粒細(xì)胞的分離、提純及培養(yǎng) 收集ICSI超排卵患者取卵術(shù)采集的卵泡液(不含卵母細(xì)胞及卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物)，采用密度梯度離心法分離[7]，具體操作為：300×g離心10 min，棄上清，用2 mL PBS液重懸，加入2 mL胰酶， 37 ℃消化10 min后加入1 mL顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化;后300×g離心30 min,棄上清，加入2 mL PBS液重懸，小心加入2 mL Ficoll液面上，400×g離心20 min。離心后顆粒細(xì)胞位于上層混合液和下層Ficoll液交界液面處，用移液管輕柔吸取，加入3 mL PBS液，300×g離心3 min后棄上清，用顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液重懸沉淀，接種6孔板, 置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 24 h后全量換液1次，之后每48 h全量換液1 次，光學(xué)顯微鏡觀察顆粒細(xì)胞形態(tài)。

2.3細(xì)胞鑒定 分別取培養(yǎng)至第3代的2種顆粒細(xì)胞，接種于12孔板中，培養(yǎng)至融合度60%時(shí)用PBS清洗2次，4%多聚甲醛4 ℃固定20 min，PBS沖洗3次,每次5 min，用含0.1% Triton X-100的BSA液破膜并封閉1 h，PBS沖洗3次，每次5 min，用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)FSHR抗體表達(dá)情況，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)紅染為陽性；Hoechst 33342檢測(cè)細(xì)胞核，胞核表現(xiàn)為藍(lán)染。

2.4細(xì)胞生長曲線的檢測(cè) 取2種顆粒細(xì)胞培養(yǎng)至融合度70%～80%時(shí)傳代，吸去培養(yǎng)液，PBS清洗1遍，胰酶消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度為1×109/L，接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每48 h全量換液1次。取第3代的2種顆粒細(xì)胞，以5×106/L密度接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后全量換液1次，之后每48 h全量換液1次。于培養(yǎng)第1、3、5、7、9和11天時(shí)點(diǎn)每孔添加10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在450 mm波長處的吸光度(A)。

2.5雌激素檢測(cè) 取第3代的2種顆粒細(xì)胞，以1×109/L的密度接種于6孔板中，24 h后全量換液1次，每48 h全量換液1次，收集培養(yǎng)第1、3、5、7、9和11天的細(xì)胞培養(yǎng)液，-80 ℃儲(chǔ)存，用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基中雌激素含量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

12種顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

人CCs原代提取于撿卵時(shí)進(jìn)行卵母細(xì)胞ICSI前處理，用細(xì)針切割卵母細(xì)胞周圍卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合體而得，幾乎沒有紅細(xì)胞殘留，24 h后培養(yǎng)基中復(fù)合體內(nèi)顆粒細(xì)胞大部分貼壁生長，培養(yǎng)24 h后換液將剩余漂浮復(fù)合體團(tuán)塊洗去，顯微鏡下觀察到顆粒細(xì)胞生長分散，細(xì)胞伸展充分，見圖1A；人MGCs原代提取培養(yǎng)24 h后大部分貼壁生長，但仍有較多數(shù)量紅細(xì)胞混雜，見圖1B，紅細(xì)胞并未對(duì)顆粒細(xì)胞貼壁產(chǎn)生明顯影響，培養(yǎng)24 h后全量換液可去除大部分殘留紅細(xì)胞。

Figure 1. The representative images ofinvitrocultured human cumulus cells and human mural granulosa cells (×200). A: human cumulus cells after 24 h of incubation; B: human mural granulosa cells after 24 h of incubation. a: human cumulus cells; b: human mural granulosa cells; c: remaining erythrocytes. The scale bar=50 μm.

圖1體外培養(yǎng)的人卵丘顆粒細(xì)胞和人壁層顆粒細(xì)胞

2種顆粒細(xì)胞貼壁后外觀相似，均呈梭形或多突狀，胞核大、圓，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)顆粒豐富、均勻，細(xì)胞間偽足連接緊密。體外培養(yǎng)這2種細(xì)胞在第3～7天分裂能力達(dá)到峰值，第7～9天進(jìn)入生長平臺(tái)期，隨后出現(xiàn)退化現(xiàn)象，懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞出現(xiàn)類成纖維細(xì)胞形態(tài)改變。

2免疫熒光鑒定顆粒細(xì)胞

對(duì)2種顆粒細(xì)胞進(jìn)性免疫熒光方法檢測(cè)FSHR表達(dá)，結(jié)果顯示， 胞質(zhì)呈紅色，說明FSHR表達(dá)陽性，陽性率達(dá)90%以上，表明2種來源所得細(xì)胞均為顆粒細(xì)胞，見圖2。

Figure 2. Immunofluorescence staining of human cumulus cells and human mural granulosa cells (×400). The scale bar=20 μm.

圖2人卵丘顆粒細(xì)胞和人壁層顆粒細(xì)胞的免疫熒光觀察

3細(xì)胞生長曲線比較

CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第1天，2種顆粒細(xì)胞貼壁數(shù)量相當(dāng)；培養(yǎng)第3、5及7天，人CCs數(shù)量均較人MGCs多；第9及11天結(jié)果顯示， CCs開始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡而MGCs進(jìn)入生長平臺(tái)期。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示2種顆粒細(xì)胞的生長曲線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

4雌激素分泌能力比較

Figure 3. The growth curves of human cumulus cells and human mural granulosa cells. Mean±SD.n=10.

圖3人卵丘顆粒細(xì)胞和人壁層顆粒細(xì)胞生長曲線

ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， MGCs分泌雌激素稍多于CCs[(3.17±0.33) nmol/Lvs(2.95±0.14) nmol/L]，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示2種顆粒細(xì)胞分泌雌激素量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見圖4。

Figure 4. Estrogen contents in the culture media of human cumulus cells and human mural granulosa cells. Mean±SD.n=10.

圖4人卵丘顆粒細(xì)胞和人壁層顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液雌激素含量

討 論

卵巢顆粒細(xì)胞是卵母細(xì)胞生長發(fā)育內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，其體外培養(yǎng)模型的建立對(duì)研究多能干細(xì)胞分化具有重要意義，如在生殖系細(xì)胞發(fā)生的熱點(diǎn)研究中，將干細(xì)胞與MGCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MGCs能促進(jìn)干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞進(jìn)一步分化[8-10]。此外，MGCs的體外模型有助于研究其與卵母細(xì)胞的互相調(diào)節(jié)機(jī)制，并且可以為卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)及多能干細(xì)胞與顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)的研究提供不同的顆粒細(xì)胞亞類來源[11-13]。不過，上述研究的開展大部分取用壁層顆粒細(xì)胞作為研究對(duì)象，CCs作為顆粒細(xì)胞亞群之一，與卵母細(xì)胞處于同一微環(huán)境中，其所起到的作用與MGCs不同[14]，因此需要建立CCs培養(yǎng)體系，為研究卵母細(xì)胞發(fā)生和干細(xì)胞共培養(yǎng)等研究提供不同的顆粒細(xì)胞亞群。

細(xì)胞建系的關(guān)鍵在于原代顆粒細(xì)胞的分離和提純方法，本實(shí)驗(yàn)采用直接培養(yǎng)法對(duì)CCs進(jìn)行原代提取，比傳統(tǒng)密度梯度離心法分離MGCs更為簡單方便[15]。直接法無需消化及離心操作，有研究指出[16]，CCs生長發(fā)育受卵母細(xì)胞分泌因子的調(diào)控，脫離了卵母細(xì)胞的單獨(dú)CCs不適宜長期體外培養(yǎng)，不過該項(xiàng)研究基于山羊模型，因此所得結(jié)論可能不適用于人CCs的體外培養(yǎng)。此外，有國內(nèi)學(xué)者認(rèn)為[17]，卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物中的黏液團(tuán)會(huì)影響顆粒細(xì)胞的提純及生長活性。與卵母細(xì)胞體外受精操作中對(duì)卵母細(xì)胞-卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物的處理比較而言，ICSI操作機(jī)械切割卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物的體積更大，剝除的顆粒細(xì)胞更多，本實(shí)驗(yàn)選取ICSI促排獲卵超過20個(gè)的患者作為原代提取樣本，所收集的卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物量較多。本研究結(jié)果顯示，雖然黏液團(tuán)未經(jīng)消化，但CCs在培養(yǎng)24 h后可從黏液團(tuán)中爬向皿底并貼壁，后續(xù)生長的顆粒細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與MGCs相似，未見明顯異常。CCs樣本收集前經(jīng)過MOPS液沖洗2次，基本不含血細(xì)胞影響，培養(yǎng)24 h后可除去絕大部分黏液團(tuán)塊，此法可保證細(xì)胞純度的同時(shí)，操作簡單。本實(shí)驗(yàn)原代樣本取自ICSI促排獲卵超過20個(gè)的患者，若種皿時(shí)選取6孔板及更大面積培養(yǎng)皿，CCs 24 h后貼壁密度低，會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的生長受到影響。本實(shí)驗(yàn)提示， 如果12孔板中每孔原代樣本量少20個(gè)卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物，會(huì)因?yàn)橘N壁的顆粒細(xì)胞密度過低，導(dǎo)致接下來的生長受到影響。但由于沒有對(duì)黏液團(tuán)塊進(jìn)行消化處理，無法提供定量種皿的細(xì)胞數(shù)，是本實(shí)驗(yàn)的不足之處。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，CCs的體外培養(yǎng)生長特點(diǎn)和雌激素分泌功能和MGCs相似。目前，有關(guān)人顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的選擇文獻(xiàn)報(bào)道不一[18-20]，本實(shí)驗(yàn)綜合當(dāng)前研究報(bào)道，選擇含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基作為MGCs及CCs培養(yǎng)基，且未在培養(yǎng)基中添加卵泡液。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCs體外生長情況良好，伸展性佳，具有和MGCs相當(dāng)?shù)纳L能力，因此提示本實(shí)驗(yàn)選用的培養(yǎng)基適用于CCs的體外培養(yǎng)；FSHR抗體免疫熒光結(jié)果表明，從卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物中分離所得細(xì)胞為顆粒細(xì)胞[21]；ELISA檢測(cè)雌激素結(jié)果提示，分離所得CCs分泌雌激素能力和MGCs相似，提示我們CCs在體外培養(yǎng)后同樣具有雌激素分泌功能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了一種有效的分離、提取和培養(yǎng)人CCs的方法，且操作簡便，并通過與經(jīng)典的人MGCs體外培養(yǎng)方法比較，結(jié)果顯示， 人CCs具有良好的體外生長能力以及雌激素分泌功能，為有關(guān)顆粒細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)、卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)和誘導(dǎo)干細(xì)胞-顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)等研究提供了不同的顆粒細(xì)胞亞群。

[1] Bao B, Garverick HA. Expression of steroidogenic enzyme and gonadotropin receptor genes in bovine follicles during ovarian follicular waves: a review[J]. J Anim Sci, 1998, 76(7):1903-1921.

[2] Webb R, Campbell BK, Garverick HA, et al. Molecular mechanisms regulating follicular recruitment and selection[J]. J Reprod Fertil Suppl, 1999, 54(54):33-48.

[3] Eppig JJ. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals[J]. Reproduction, 2001, 122(6):829-838.

[4] Havelock JC, Rainey WE, Carr BR. Ovarian granulosa cell lines[J]. Mol Cell Endocrinol, 2004, 228(1-2):67-78.

[5] Matzuk MM, Burns KH, Viveiros MM, et al. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation[J]. Science, 2002, 296(5576):2178-2180.

[6] Gilchrist RB, Lane M, Thompson JG. Oocyte-secreted factors: regulators of cumulus cell function and oocyte quality[J]. Hum Reprod Update, 2008, 14(2):159-177.

[7] Chen SU, Chen RJ, Shieh JY, et al. Human chorionic gonadotropin up-regulates expression of myeloid cell leukemia-1 protein in human granulosa-lutein cells: implication of corpus luteum rescue and ovarian hyperstimulation syndrome[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2010, 95(8):3982-3992.

[8] Qing T, Shi Y, Qin H, et al. Induction of oocyte-like cells from mouse embryonic stem cells by co-culture with ovarian granulosa cells[J]. Differentiation, 2007, 75(10):902-911.

[9] Chen HF, Jan PS, Kuo HC, et al. Granulosa cells and retinoic acid co-treatment enrich potential germ cells from manually selected Oct4-EGFP expressing human embryonic stem cells[J]. Reprod Biomed Online, 2014, 29(3):319-332.

[10] 張武文， 黃麗麗， 莊亞玲， 等. 巨噬細(xì)胞集落刺激因子及其受體mRNA在人卵泡顆粒細(xì)胞和胎盤及子宮內(nèi)膜中的表達(dá)[J]. 中國病理生理雜志, 2007, 23(9):1850-1852.

[11] Sela-Abramovich S, Edry I, Galiani D, et al. Disruption of gap junctional communication within the ovarian follicle induces oocyte maturation[J]. Endocrinology, 2006, 147(5):2280-2286.

[12] 文艷飛， 蔡柳洪， 何 文， 等. 卵巢早衰患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建系、鑒定及誘導(dǎo)分化[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(1):140-145.

[13] Vanderhyden BC, Armstrong DT. Role of cumulus cells and serum on theinvitromaturation, fertilization, and subsequent development of rat oocytes[J]. Biol Reprod, 1989, 40(4):720-728.

[14] Maalouf WE, Lee JH, Campbell KH. Effects of caffeine, cumulus cell removal and aging on polyspermy and embryo development oninvitromatured and fertilized ovine oocytes[J]. Theriogenology, 2009, 71(7):1083-1092.

[16] Romaguera R, Morató R, Jiménezmacedo AR, et al. Oocyte secreted factors improve embryo developmental competence of COCs from small follicles in prepubertal goats[J]. Theriogenology, 2010, 74(6):1050-1059.

[17] 江 歡， 謝寶國， 羅 琛， 等. 兩種人卵巢顆粒細(xì)胞分離提純方法的比較研究[J]. 生殖與避孕, 2012, 32(11):728-732.

[18] Sutton ML, Gilchrist RB, Thompson JG. Effects ofin-vivoandin-vitroenvironments on the metabolism of the cumulus-oocyte complex and its influence on oocyte developmental capacity[J]. Hum Reprod Update, 2003, 9(1):35-48.

[19] Somigliana E, Viganò P, La Sala GB, et al. Follicular fluid as a favourable environment for endometrial and endometriotic cell growthinvitro[J]. Hum Reprod, 2001, 16(6):1076-1080.

[20] 劉玉霞， 董靜霞， 金玉潔， 等. 人卵巢顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法探討[J]. 中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志, 2011, 20(5):436-439.

[21] Simoni M, Gromoll J, Nieschlag E. The follicle-stimulating hormone receptor: biochemistry, molecular biology, physiology, and pathophysiology[J]. Endocr Rev, 1997, 18(6):739-773.