吸煙COPD模型大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡蛋白CHOP的表達(dá)*

甘桂香， 胡瑞成， 譚雙香

(湖南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 湖南 長沙 410016)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，其病情常呈進(jìn)行性發(fā)展，最終導(dǎo)致患者勞動能力喪失和死亡，給社會造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。香煙煙霧(cigarette smoke, CS)中的氧化性物質(zhì)可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)COPD的發(fā)生發(fā)展[1]。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)在正常生理狀態(tài)下基本檢測不到，但在ERS狀態(tài)下表達(dá)顯著升高，是ERS的標(biāo)志。本研究通過TUNEL法檢測肺組織細(xì)胞的凋亡，并通過檢測PERK/eIF2α信號通路在COPD大鼠中的表達(dá)情況，為COPD的防治提供新方向。

材 料 和 方 法

1動物

清潔級雄性Wistar大鼠40只(湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，動物合格證編號為SCXK(湘)2013-0003，體重(200±20) g，鼠齡10周。將大鼠隨機(jī)分為對照(control)組、吸煙2個(gè)月(exposed to CS for 2 months, CS-2)組、吸煙4個(gè)月(CS-4)組及戒煙1個(gè)月(ex-smoking, Ex-S)組，每組10只。參照王慧等[2]方法建立COPD大鼠模型，每日將大鼠置于自制染毒箱內(nèi),暴露于10支香煙中2次(對照組大鼠也置于染毒箱內(nèi)做偽暴露)，每次1 h，2次之間相隔不少于 4 h；開始燃燒4支香煙,隨后每次2支香煙，每支香煙燃燒約12 min，換煙間歇3 min。吸煙組分別吸煙2個(gè)月和4個(gè)月;戒煙1個(gè)月組即大鼠吸煙4個(gè)月后暴露于常氧條件下1個(gè)月。

2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

芙蓉牌香煙(湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，尼古丁1.0 mg/支，焦油12 mg/支)；TUNEL試劑盒購自武漢博士德生物公司；抗蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、p-PERK、真核起始因子(eukaryotic initiation factor, eIF)2α、p-eIF2α和CHOP抗體購自Santa Cruz；抗β-actin抗體、總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、SABC免疫組化試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗、DAB顯色劑和原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物公司；地高辛標(biāo)記的CHOP多相寡核苷酸探針購自北京鼎國生物有限公司；Western blot化學(xué)發(fā)光劑購自上海碧云天生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 MBI Fermentas；DNA Marker購自北京索萊寶生物科技有限公司。小動物肺功能測定系統(tǒng)和HX200型呼吸流量換能器購自北京新行興業(yè)科貿(mào)有限公司；蛋白電泳系統(tǒng)購自Bio-Rad；PCR儀購自Eppendorf；PAS 900病理圖像分析系統(tǒng)購自無錫朗伽生物工程有限公司；GIS-2010型凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；ELx800熒光酶標(biāo)儀購自BioTek。CHOP的上游引物為5’-GCATCTTCATACACCACCACA-3’，下游引物為5’-TCATTCTCCTGCTCCTTCTC-3’；β-actin的上游引物為5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’，下游引物為5’-ATGTCACGCACGATTTCCC-3’。

3主要方法

3.1肺功能的測定 用小動物肺功能測定系統(tǒng)測定0.3秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 0.3 second, FEV0.3)占用力肺活量(forced vital capacity, FVC)的比值(FEV0.3/FVC)和呼氣峰流速(peak expiratory flow, PEF)。以1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，暴露氣管，行氣管插管，并與數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)相連，在描記一段平靜的呼吸后，在呼氣末用注射器經(jīng)三通管迅速打進(jìn)6 mL空氣(相當(dāng)于深吸氣)，然后立即脫開，連接負(fù)壓(-25 cmH2O， 1 cmH2O=0.098 kPa)抽氣(相當(dāng)于深呼氣)，經(jīng)微機(jī)處理計(jì)算上述指標(biāo)[3]。

3.2組織標(biāo)本的留取 吸煙2個(gè)月組和4個(gè)月組大鼠末日吸香煙后，2 h內(nèi)與對照組和戒煙組一起放血處死，將氣管與雙肺暴露，結(jié)扎右主支氣管，用接12號針頭(尖端磨平)的注射器經(jīng)氣管切開口向左肺注入4%多聚甲醛(含1‰ DEPC),至左肺復(fù)張后，結(jié)扎左主支氣管。將右肺取出置于液氮中速凍，用于Western blot和RT-PCR；取出左肺浸入4%多聚甲醛(含1‰ DEPC)中固定，常規(guī)石蠟包埋。

3.3肺組織形態(tài)學(xué)的觀察 取石蠟包塊切片，厚度4 μm，每只大鼠選3張肺組織切片，二甲苯、乙醇脫蠟至水，蘇木素浸染，鹽酸乙醇分化，伊紅溶液復(fù)染，再脫水透明封片，光鏡下觀察。

3.4TUNEL法檢測肺組織中的凋亡細(xì)胞 取石蠟包塊切片，厚度4 μm，每只大鼠選3張肺組織切片，二甲苯、乙醇脫蠟至水，加胃蛋白酶K于37 ℃消化20 min，滴加雙氧水甲醇于室溫30 min以滅活內(nèi)源性酶，滴加50 μL的TUNEL 反應(yīng)混合溶液，在濕盒中37 ℃ 孵育60 min，在孵育過程中覆蓋蓋玻片。按TUNEL檢測試劑盒操作，DAB顯色，陽性結(jié)果為棕黃色，PAS 900病理圖像分析系統(tǒng)采集并分析圖像。

3.5原位雜交檢測肺組織中CHOP的mRNA表達(dá) 取石蠟包塊切片，厚度4 μm，每只大鼠選3張肺組織切片，二甲苯、乙醇脫蠟至水，用3% H2O2封閉10 min，加20 μL預(yù)雜交液于濕盒內(nèi)42 ℃恒溫箱預(yù)雜交3.5 h；加20 μL雜交探針溶液，蓋上原位雜交專用蓋玻片置濕盒內(nèi)，于40 ℃恒溫箱內(nèi)雜交20 h；在干燥環(huán)境中繼續(xù)雜交2 h，洗滌、封閉，按原位雜交試劑盒說明書依次加入生物素化鼠抗地高辛、鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物ABC，DAB顯色，陽性結(jié)果為棕黃色。

3.6RT-PCR檢測CHOP的mRNA表達(dá) 取右肺組織0.2 g，按說明書用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為： 94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性30 s， 72 ℃延伸5 min。CHOP的退火溫度為56 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物為432 bp；β-actin的退火溫度為56 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物為260 bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)掃描分析擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，分別測定各擴(kuò)增帶吸光度(A)，將目的基因的擴(kuò)增條帶與內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增帶的吸光度比值作為其mRNA表達(dá)水平的相對指標(biāo)。

3.7免疫組化檢測肺組織中CHOP的蛋白表達(dá) 取石蠟包塊切片，厚度4 μm，每只大鼠選3張肺組織切片，二甲苯、乙醇脫蠟至水，用3% H2O2封閉10 min，微波爐熱抗原修復(fù)3次，每次10 min，冷卻至室溫后滴加封閉液，按SABC檢測試劑盒操作。I抗用PBS稀釋(CHOP 1∶100)，孵育I抗, 4 ℃過夜。滴加相應(yīng)II抗和SABC試劑， DAB顯色，陽性結(jié)果為棕黃色。PAS 900病理圖像分析系統(tǒng)采集和分析圖像。

3.8Western blot法檢測肺組織中PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平 于液氮中取出大鼠右肺組織,按照總蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，并依據(jù)BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書測定蛋白濃度。嚴(yán)格按照Western blot實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。抗PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP和β-actin I抗均按1∶500封閉液稀釋， II 抗1∶1 000稀釋。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法X膠片顯影定影后掃描至計(jì)算機(jī)，圖像分析系統(tǒng)對擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度半定量分析。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多個(gè)樣本比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1大鼠肺功能的變化

與對照組比較，吸煙2個(gè)月組大鼠FEV0.3/FVC與PEF明顯下降，吸煙4個(gè)月組肺功能較吸煙2個(gè)月組進(jìn)一步下降，而戒煙組大鼠肺功能有所好轉(zhuǎn)(P<0.01)，見表1。

表1各組大鼠肺功能的變化

Table 1. Pulmonary function changes in each group (Mean±SD.n=10)

GroupFEV03/FVC(%)PEF(mL/s)Control83．47±4．9840．11±3．66CS?275．48±2．57?33．42±3．21?CS?466．18±4．12?△25．89±2．22?△Ex?S69．35±2．45?#28．41±2．30?#

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsCS-2 group;#P<0.05vsCS-4 group.

2肺組織的病理學(xué)變化

與對照組相比，吸煙2個(gè)月組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管肺內(nèi)出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤,支氣管壁杯狀細(xì)胞數(shù)目增多，腺體增生肥大，部分肺泡出現(xiàn)破裂；吸煙4個(gè)月組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂更明顯，支氣管肺內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，腺體增生肥大明顯，肺泡壁破裂，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成肺大泡；戒煙組大鼠肺泡腔擴(kuò)大,較吸煙4個(gè)月組無顯著改變,見圖1。

Figure 1. The morphological characters of the rat lung tissues in each group (HE staining, ×200). A: control group; B: CS-2 group; C: CS-4 group; D: Ex-S group.

圖1各組大鼠肺組織的形態(tài)學(xué)改變

3COPD大鼠中的肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡

肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞的凋亡超過增殖是COPD的主要發(fā)病機(jī)制。TUNEL法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組、吸煙2個(gè)月組、吸煙4個(gè)月組和戒煙組大鼠肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞的凋亡率分別為(11.442±1.724)%、(22.400±1.615) %、(34.830±3.201)%和(31.360±1.820)%；凋亡的細(xì)胞主要是Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞，見圖2。

4肺組織中CHOP的mRNA表達(dá)

原位雜交結(jié)果光鏡下見CHOP的mRNA主要表達(dá)于支氣管和肺泡上皮細(xì)胞中，在對照組中弱表達(dá)，吸煙2個(gè)月組大鼠稍增強(qiáng)，在吸煙4個(gè)月大鼠表達(dá)最明顯，呈黃色，在戒煙組大鼠和吸煙4個(gè)月大鼠表達(dá)無差異。RT-PCR檢測結(jié)果示,吸煙2個(gè)月大鼠CHOP較對照組明顯升高(P<0.05)，吸煙4個(gè)月大鼠較2個(gè)月大鼠比較則進(jìn)一步升高(P<0.05)，而戒煙組大鼠與吸煙4個(gè)月大鼠相比較則無顯著差異，與原位雜交的結(jié)果一致,見圖3。

5大鼠肺組織中PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α及CHOP蛋白水平的變化

免疫組化光鏡下見，CHOP主要在支氣管、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的胞核中表達(dá)。其在對照組中弱表達(dá)，吸煙2個(gè)月組大鼠稍增強(qiáng)，在吸煙4個(gè)月大鼠表達(dá)最明顯(P<0.05)，呈黃色，在戒煙組大鼠和吸煙4個(gè)月大鼠表達(dá)無差異,見圖4。Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比，吸煙2個(gè)月組大鼠p-PERK、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平明顯上升，在吸煙4個(gè)月組進(jìn)一步顯著升高(P<0.05)，在戒煙組中稍下降，而PERK和eIF2α在各組蛋白水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖5。

Figure 2. Apoptotic cell death in the rat lung tissues after exposure to CS (×200). The sections of the rat lung tissues were prepared and subjected to TUNEL assay for visualizing apoptotic cells (yellow). A: control group; B: CS-2 group; C: CS-4 group; D: Ex-s group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsCS-2 group.

圖2各組大鼠的肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡

6肺功能、肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡率與CHOP蛋白及mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性分析

肺功能(FEV0.3/FVC和PEF)與凋亡率之間呈負(fù)相關(guān),與CHOP表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)； CHOP的mRNA與蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，見表2。

討 論

COPD是呼吸系統(tǒng)的常見疾病,其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除炎癥、氧化應(yīng)激和蛋白酶/抗蛋白酶失衡機(jī)制之外，肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡超過增殖導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)不能維持是COPD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[4-6]。目前一般認(rèn)為，香煙煙霧引起氧化應(yīng)激是導(dǎo)致COPD肺泡上皮細(xì)胞凋亡的主要原因，但是關(guān)于氧化應(yīng)激引起COPD肺泡上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究仍不多見。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞的凋亡機(jī)制是目前COPD發(fā)病機(jī)制研究的重要內(nèi)容[7]。本研究采用單純被動吸煙法復(fù)制大鼠COPD模型，吸煙2個(gè)月大鼠肺功能較對照組大鼠明顯下降，病理學(xué)檢查結(jié)果顯示肺結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡出現(xiàn)破裂，TUNEL結(jié)果顯示吸煙2個(gè)月大鼠的凋亡細(xì)胞明顯增加，而吸煙4個(gè)月后發(fā)現(xiàn)大鼠肺功能呈阻塞性通氣障礙，表明大鼠吸煙4個(gè)月后COPD模型復(fù)制成功，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄，部分融合成肺大泡，大鼠組織病理學(xué)檢查結(jié)果符合慢性支氣管炎和阻塞性肺氣腫改變，而TUNEL結(jié)果顯示其凋亡率較吸煙2個(gè)月大鼠則進(jìn)一步的增加。相關(guān)分析顯示肺功能與凋亡率呈負(fù)相關(guān)，表明吸煙能導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞的凋亡，肺結(jié)構(gòu)破壞不能維持其正常功能。而戒煙組的肺功能較吸煙4個(gè)月組稍下降，TUNEL結(jié)果顯示其凋亡率和吸煙4個(gè)月組比較沒有明顯改變。吸煙是COPD發(fā)生發(fā)展的最重要危險(xiǎn)因素，COPD的病理學(xué)表現(xiàn)為慢性支氣管炎和阻塞性肺氣腫，COPD的病理變化是不可逆的，戒煙是COPD的重要干預(yù)措施。推測戒煙后其氣道炎癥和肺氣腫仍持續(xù)進(jìn)展；戒煙只能減慢COPD進(jìn)展的速度；而不能阻止COPD進(jìn)展。

Figure 3. The distribution and expression of CHOP mRNA in rat lung tissues. The sections of the rat lung tissues were prepared and subjected toinsituhybridization for visualizing the distribution of CHOP mRNA in the cells and the mRNA was mainly located in nucleus (×200). The mRNA expression of CHOP was also detected by RT-PCR. A: control group; B: CS-2 group; C: CS-4 group; D: Ex-S group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsCS-2 group.

圖3肺組織中CHOPmRNA的分布和表達(dá)

Figure 4. The sections of the rat lung tissues were prepared and subjected to immunohistochemical staining for visualizing the distribution of CHOP protein (×200). A: control group; B: CS-2 group; C: CS-4 group; D: Ex-S group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsCS-2 group.

圖4肺組織中CHOP蛋白的表達(dá)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)負(fù)責(zé)真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)(膜蛋白和分泌蛋白)的合成、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)和鈣離子濃度的調(diào)節(jié)。氧化應(yīng)激、細(xì)胞毒性物質(zhì)、缺氧、DNA損傷和病毒感染等許多因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊、未折疊蛋白聚集和鈣離子平衡紊亂，出現(xiàn)ERS，ERS狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積聚增多，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜感應(yīng)蛋白，再通過其下游的信號調(diào)節(jié)通路介導(dǎo)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)活動或啟動細(xì)胞凋亡/自噬程序，稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。哺乳動物UPR具有3條跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別由肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、PERK和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)執(zhí)行跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8-11]?；罨腜ERK迅速使eIF2α磷酸化，減少分泌蛋白的翻譯以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)載?；罨腎RE1具有核酸內(nèi)切酶活性，剪接X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein-1，XBP1)mRNA前體形成有活性的XBP1 mRNA，后者進(jìn)一步翻譯出具有功能活性的蛋白質(zhì)。哺乳動物的ATF6包含α和β兩種亞型，只有ATF6α參與UPR，水解活化的ATF6α進(jìn)入細(xì)胞核與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件結(jié)合并激活分子伴侶基因的表達(dá)，或者與XBP1結(jié)合形成異二聚體，再通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性蛋白降解相關(guān)基因和XBP1基因的表達(dá)。本研究的Western blot結(jié)果顯示，PERK以及eIF2α在各組表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而p-PERK以及p-eIF2α則在對照組大鼠中的蛋白水平是最低的，在吸煙2個(gè)月大鼠中明顯升高，在吸煙4個(gè)月大鼠中則進(jìn)一步明顯上升，而戒煙組大鼠則沒有顯著差別。由此得知吸煙可促進(jìn)肺組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

Figure 5. The relative protein expression of PERK, p-PERK, eIF2α, p-eIF2α and CHOP detected by Western blot. A: control group; B: CS-2 group; C: CS-4 group; D: Ex-S group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsCS-2 group.

圖5肺組織中PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α和CHOP的蛋白水平

表2肺功能、肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡率和CHOP表達(dá)之間的相關(guān)性分析

Table 2. Linear correlation analysis between different parameters of COPD rats

ParameterFEV03/FVC(%)PEF(mL/s)ApoptoticrateCHOPmRNACHOPproteinApoptosisrate-0．850-0．905-0．8760．863CHOPmRNA-0．809-0．9110．876-0．794CHOPprotein-0．792-0．8380．8630．794-

ERS是把雙刃劍，應(yīng)激時(shí)間短和輕中度應(yīng)激的細(xì)胞選擇適應(yīng)性生存，而ERS時(shí)間過長或者應(yīng)激過強(qiáng)引起細(xì)胞凋亡[4]。哺乳動物ERS誘導(dǎo)的凋亡主要有3條信號通路：CHOP信號通路、凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)-JNK信號通路和caspase-12信號通路[8, 10]。CHOP在正常生理狀態(tài)下基本檢測不到, 其是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的促凋亡分子,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡中發(fā)揮重要作用，它阻斷細(xì)胞增殖及通過調(diào)節(jié)其下游基因包括DOCs (downstream of CHOP)和caspase-1誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡，也可抑制Bcl-2和上調(diào)Bax 水平介導(dǎo)細(xì)胞死亡，但在ERS狀態(tài)下表達(dá)顯著升高，是ERS的標(biāo)志[8, 12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激發(fā)生時(shí)，可通過PERK 介導(dǎo)的eIF2α磷酸化同時(shí)，也提升 mRNA與核糖體的結(jié)合效率，促進(jìn)ATF4 的翻譯，ATF4 則轉(zhuǎn)入核后，誘導(dǎo)CHOP基因的表達(dá)，CHOP通過線粒體促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過吸煙2個(gè)月組大鼠p-PERK的蛋白水平增加，同時(shí) CHOP蛋白表達(dá)上調(diào)，在吸煙4個(gè)月大鼠則更加明顯。表明吸煙可引起肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生發(fā)展。

總之，本實(shí)驗(yàn)在動物層面研究證實(shí)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與了COPD的發(fā)生發(fā)展。然而香煙煙霧在細(xì)胞層面是否發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及是否有其它通路參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)性凋亡需進(jìn)一步研究。

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