Notch信號(hào)在脂多糖誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的作用*

王繼榮， 盧 艷， 岳影星， 代繼桓， 楊舟鑫△

(浙江醫(yī)院 1浙江省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2放射科， 浙江 杭州 310013)

從骨髓中分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以黏附在塑料培養(yǎng)瓶中快速增殖，并具有向脂肪、骨髓和軟骨細(xì)胞分化的能力，因此可以作為細(xì)胞替代治療的種子細(xì)胞[1]。MSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，在多種免疫相關(guān)疾病中被認(rèn)為有良好的應(yīng)用前景。最近研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可通過(guò)再生修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗凋亡等減輕炎癥反應(yīng)[2]。

Notch信號(hào)通路在進(jìn)化上高度保守，通過(guò)相鄰細(xì)胞之間的相互作用對(duì)造血干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞及T和B淋巴細(xì)胞的發(fā)育和功能的發(fā)揮都有重要的調(diào)節(jié)作用，并參與腫瘤、病毒感染、炎癥反應(yīng)和自身免疫疾病等免疫相關(guān)疾病的發(fā)生[3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)信號(hào)能增強(qiáng)Notch途徑的活性，而且更重要的是，Notch1和Notch2活性形式的過(guò)量表達(dá)，會(huì)抑制TLR4開(kāi)啟的炎癥細(xì)胞因子[如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 和白細(xì)胞介素6(intreleukin-6，IL-6)]的生成，并且促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的生成[4]。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以被細(xì)胞表面TLR4識(shí)別，繼而引發(fā)多種細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[5]。然而，Notch信號(hào)是否參與LPS所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)尚不明確。在本研究中，我們探討了Notch信號(hào)通路對(duì)LPS所誘導(dǎo)的BMSCs增殖和炎癥因子分泌的作用。

材 料 和 方 法

1主要試劑及儀器

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基為STEMCELL Technologies產(chǎn)品；PBS和胰酶為吉諾公司產(chǎn)品；脂多糖與DAPT為Sigma產(chǎn)品；RNA提取試劑盒為Qiagen產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒為Thermo產(chǎn)品；IL-6的ELISA試劑盒為eBioscience產(chǎn)品；趨化因子CXCL1的ELISA試劑盒為PeproTech產(chǎn)品。酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo；倒置相差顯微鏡購(gòu)自Leica；定量PCR儀購(gòu)自Roche。

2主要方法

2.1小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng) 6～8周雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自浙江省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，質(zhì)量合格證號(hào)為No. 1612060018。頸椎脫臼法處死小鼠后，75%乙醇中浸泡5 min，取出兩側(cè)腿骨，置于裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中小心剔除粘連于骨上的肌肉組織，剪去腿骨兩端，用1 mL注射器抽取已經(jīng)預(yù)先配好的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨發(fā)白，收集沖洗液，反復(fù)吹打使細(xì)胞打散，移至滅菌的10 mL離心管中，4 ℃、1 600 r/min離心5 min，棄上清，用小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×109/L，接種到T25培養(yǎng)瓶，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，輕輕吸出上清，并加入新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液1次，并觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.2小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化和傳代擴(kuò)增 原代細(xì)胞生長(zhǎng)至大約80%融合時(shí)，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37 ℃條件下消化至細(xì)胞呈圓形，用完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，用PBS沖洗細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到一個(gè)15 mL的離心管中， 4 ℃、1 600 r/min離心5 min，棄上清，再加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1∶3比例傳代，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞生長(zhǎng)至接近80%時(shí)，重復(fù)以上操作，再次傳代。取6～10代的間充質(zhì)干細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3MTT法和活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將BMSCs以每孔2×103的密度種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后分別加入LPS (10 μg/L、100 μg/L和1 mg/L)與DAPT(10 mg/L)，對(duì)照(control)組加入等體積DMSO。72 h后加入MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，并置于培養(yǎng)箱中，3 h后棄溶液，加入100 μL DMSO溶解并在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm處吸光度(A)。

將BMSCs以每孔3×104的密度種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后分別加入LPS(1 mg/L)與DAPT(10 mg/L)，對(duì)照組加入等體積DMSO。LPS刺激72 h后，拍照，用胰酶消化后加入2 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取20 μL細(xì)胞懸液加入80 μL臺(tái)盼藍(lán)混勻，最后用微量移液器吸取10 μL進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.4qPCR檢測(cè)基因表達(dá) BMSCs以每孔1×105的密度種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后LPS刺激組加入1 mg/L 的LPS，DAPT組加入10 mg/L的DAPT，LPS刺激24 h后，收集細(xì)胞。使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)抽提細(xì)胞總RNA，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA，并使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix來(lái)進(jìn)行qPCR。使用LightCycler 480實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀(Roche)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參照，分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性通過(guò)繪制熔解曲線來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。用于qPCR的引物見(jiàn)表1。

2.5Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) BMSCs以每孔1×105的密度種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后LPS刺激組加入1 mg/L 的LPS，LPS刺激的48 h后，收集細(xì)胞。

表1 qPCR引物

F: forward； R: reverse.

Western blot按照標(biāo)準(zhǔn)的流程進(jìn)行，主要包括：蛋白的提取和定量、電泳樣本制備及SDS-PAGE；然后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，將轉(zhuǎn)印后的膜用5% BSA室溫封閉1 h，TBST清洗后加入I抗(Notch1、Notch2、Jagged1、Dll3、Dll4和Hes1抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；Notch3、Notch4、Jagged2、Dll1和Hey1抗體購(gòu)自Abcam)4 ℃孵育過(guò)夜；TBST清洗后再用熒光II抗室溫孵育1 h；清洗后以O(shè)dyssey顯像系統(tǒng)觀察和拍攝Western blot條帶。

2.6ELISA檢測(cè)IL-6與CXCL1的分泌 吸取未加MTT的方法2.3培養(yǎng)條件下的細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用ELISA 試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)的方法，檢測(cè)IL-6或CXCL1濃度。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，經(jīng)SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)及Dunnett’s檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1LPS對(duì)BMSCs活力和IL-6分泌的影響

分離小鼠原代BMSCs，貼壁培養(yǎng)后觀察，細(xì)胞呈梭形且可以在體外迅速擴(kuò)增，進(jìn)一步經(jīng)流式分析發(fā)現(xiàn)其表達(dá)CD29與CD106而非CD31與CD45，并且具備成骨與成脂分化能力，說(shuō)明分離篩選成功，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]，本實(shí)驗(yàn)材料與該文獻(xiàn)中所用BMSCs為同一批。添加LPS刺激BMSCs，MTT結(jié)果顯示不同濃度LPS均可以促進(jìn)小鼠BMSCs的增殖，其中100 μg/L與1 mg/L有顯著作用，見(jiàn)圖1A；ELISA結(jié)果顯示10 μg/L、100 μg/L和1 mg/L LPS均可以促進(jìn)IL-6的分泌，其中1 mg/L的效果最為明顯，見(jiàn)圖1B。因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)均選取LPS濃度為1 mg/L。

2LPS對(duì)BMSCs中Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

Notch信號(hào)通路在干細(xì)胞分化與增殖中發(fā)揮重要作用，我們檢測(cè)了脂多糖對(duì)Notch信號(hào)通路受體、配體與靶基因表達(dá)的影響。qPCR結(jié)果顯示，BMSCs表達(dá)Notch信號(hào)的受體，包括Notch1～Notch4，其中Notch1和Notch3的相對(duì)表達(dá)量較高；然而，Notch信號(hào)受體的mRNA水平并沒(méi)有由于LPS的刺激而發(fā)生明顯變化，見(jiàn)圖2A。BMSCs也可檢測(cè)到Notch信號(hào)配體的表達(dá)，包括Jagged1、 Jagged2、Dll1、Dll3和Dll4，其中Jagged1的相對(duì)表達(dá)量較高；同樣，LPS并不影響Notch信號(hào)配體的mRNA水平，見(jiàn)圖2B。同時(shí)，我們利用Westerm blot檢測(cè)上述Notch信號(hào)受體與配體的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，LPS并不影響Notch信號(hào)受體與配體的蛋白水平，見(jiàn)圖3A。另外，我們檢測(cè)了Notch信號(hào)靶基因Hes1與Hey1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS顯著誘導(dǎo)Hes1與Hey1的蛋白表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。

Figure 1. The effects of LPS on the cell viability (A) and secretion of IL-6 (B) in the BMSCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1脂多糖對(duì)BMSCs活力和IL-6分泌的促進(jìn)作用

Figure 2. The mRNA expression levels of Notch receptors (A) and ligands (B) in the BMSCs treated with LPS. Mean±SD.n=4.

圖2Notch信號(hào)通路受體與配體的mRNA表達(dá)

Figure 3. The protein levels of Notch receptors, ligands and target genes in the BMSCs treated with LPS. A: Western blot assay of Notch receptors and ligands; B: Western blot assay of target genes. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖3Notch信號(hào)通路受體、配體與靶基因的蛋白水平

3Notch信號(hào)對(duì)LPS誘導(dǎo)的BMSCs增殖的影響

我們進(jìn)一步利用Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT處理BMSCs，檢測(cè)Notch信號(hào)通路對(duì)BMSCs活力的影響。MTT法結(jié)果顯示，LPS顯著提高BMSCs活力，而DAPT不僅降低對(duì)照組BMSCs活力，更顯著地抑制了LPS所誘導(dǎo)的BMSCs的活力，見(jiàn)圖4A。進(jìn)一步通過(guò)活細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法，我們確定在LPS處理組和不處理組，DAPT均可以降低BMSCs的增殖能力(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖4B。

Figure 4. The cell viability (A) and numbers (B) of BMSCs treated with DAPT in the presence or absence of LPS. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

圖4DAPT對(duì)LPS刺激下的細(xì)胞增殖的影響

4Notch信號(hào)對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-6與CXCL1分泌的影響

為了進(jìn)一步檢測(cè)Notch信號(hào)對(duì)炎癥的影響，利用LPS與Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT共同刺激BMSCs。結(jié)果顯示，LPS顯著誘導(dǎo)IL-6與CXCL1的分泌，而DAPT可以顯著降低LPS所誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6與CXCL1的濃度(P<0.01)，說(shuō)明DAPT對(duì)LPS誘導(dǎo)的BMSC細(xì)胞炎癥因子的分泌有抑制作用，見(jiàn)圖5。

Figure 5. The secretion of IL-6 (A) and CXCL1 (B) in the BMSCs treated with DAPT in the presence or absence of LPS. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsDMSO group.

圖5DAPT對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-6與CXCL1分泌的影響

討 論

在脂多糖處理下，小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，并且細(xì)胞因子如IL-6分泌能力改變。大腸桿菌、盲腸穿孔與急性肺損傷誘導(dǎo)的膿毒癥模型中，給予人MSCs均可以提高小鼠存活率，降低IL-6和TNF-α水平，同時(shí)提高抗炎因子IL-10的水平[7-9]。本研究中，我們研究了Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的作用。DAPT可以抑制LPS誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和IL-6與CXCL1的分泌，這說(shuō)明Notch信號(hào)通路對(duì)于LPS誘導(dǎo)的BMSCs性質(zhì)的改變有調(diào)節(jié)作用。

Notch信號(hào)通路對(duì)正常MSCs的增殖均存在調(diào)節(jié)作用，本研究中通過(guò)DAPT抑制Notch信號(hào)通路，也可以明顯降低BMSCs的增殖能力。Notch信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)能力已見(jiàn)于多篇文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)[10-11]。盡管LPS處理后間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的明顯上升并不一定與Notch信號(hào)通路相關(guān)，但通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路可以改變LPS誘導(dǎo)的BMSCs相關(guān)性質(zhì)的改變。這提示Notch信號(hào)通路可能是感染誘導(dǎo)干細(xì)胞變化的重要治療靶點(diǎn)。

脂多糖對(duì)MSCs的調(diào)節(jié)作用依賴于TLR4，并通過(guò)NF-κB信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路促進(jìn)MSC的增殖和成骨分化[12]。本研究也進(jìn)一步證實(shí)了LPS對(duì)BMSCs增殖和IL-6的促進(jìn)作用，在此基礎(chǔ)上，本研究表明，Notch信號(hào)通路也可以參與LPS誘導(dǎo)的BMSC的增殖能力和IL-6與CXCL1分泌的變化。Li等[13]發(fā)現(xiàn)在再生障礙性貧血小鼠模型中MSCs通過(guò)Notch/RBP-J/FOXP3/ROR信號(hào)調(diào)節(jié)Treg/Th17的平衡。Notch信號(hào)通路可以上調(diào)NF-κB的活性[14]；Notch信號(hào)通路和Wnt信號(hào)也有協(xié)同作用[10, 15]。因此，Notch信號(hào)通路可能是通過(guò)與NF-κB和Wnt信號(hào)通路相互作用，共同調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的性質(zhì)。

總之，Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT可以抑制LPS誘導(dǎo)的BMSCs增殖及IL-6和CXCL1的分泌。本項(xiàng)研究的結(jié)果為研究膿毒癥等疾病中間充質(zhì)干細(xì)胞性質(zhì)的變化提供了更多的信息，為間充質(zhì)干細(xì)胞在這些疾病中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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