白藜蘆醇緩解完全弗氏佐劑所致小鼠炎性痛的NF-κB信號通路機制

王麗君， 仝 雷

(鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 1醫(yī)學(xué)機能教研室， 2醫(yī)學(xué)形態(tài)教研室， 河南 鄭州 451100)

炎性痛(inflammatory pain，IP)是由外傷、手術(shù)創(chuàng)傷、化學(xué)物質(zhì)和微生物感染等各種原因引起的組織損傷，各種刺激因素引起肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和神經(jīng)末梢等釋放炎癥因子，引起局部組織炎癥反應(yīng)，同時伴有局部紅、腫、熱、痛和功能障礙等，表現(xiàn)為炎癥區(qū)域的原發(fā)性痛和周邊的繼發(fā)性痛，以痛覺過敏、痛覺超敏及自發(fā)痛為特征，嚴(yán)重時可影響患者工作和生活質(zhì)量[1-3]。因此，研究炎性痛的發(fā)生機制并尋找有效的緩解措施是疼痛防治的重點與難點。研究表明，多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及炎癥介質(zhì)參與了炎性痛的形成和發(fā)展，其中核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路及相關(guān)的炎癥因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)等起著重要作用[4-5]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種從花生、藜蘆、葡萄、虎杖和桑椹等植物中提取的具有生物活性的多酚類化合物，具有抗氧化應(yīng)激、舒張血管、誘導(dǎo)自噬、促凋亡、抗腫瘤、抗病毒、抗抑郁及保護腦缺血損傷等藥理活性，且對炎癥和疼痛有較好的緩解作用[6-8]。為了進一步闡明白藜蘆醇抗炎鎮(zhèn)痛的作用機制，本研究采用完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)小鼠足底注射法復(fù)制炎性痛動物模型，同時給予白藜蘆醇進行干預(yù)，觀察其對小鼠炎性痛的改善作用及對NF-κB信號通路的影響，探討其抗炎性痛作用和相關(guān)機制。

材 料 和 方 法

1動物、試劑與儀器

60只清潔級健康BALB/c小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK (豫)2010-0002。將小鼠飼養(yǎng)于溫度(23±2) ℃、濕度45%～65%的動物室，普通飲食飲水。白藜蘆醇(純度98%)購自南京景竹生物科技有限公司，臨用時以0.5%羧甲基纖維素鈉混懸備用；完全弗氏佐劑(F5881-10ML-PW, 批號068K8761)購自Sigma；地塞米松(dexamethasone，Dex; 每片0.75 mg，批號20160324)購自廣東華南藥業(yè)集團有限公司產(chǎn)品；兔抗小鼠NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α，IκBα)、IκB激酶β(IκB kinase β，IKKβ)、TNF-α、IL-1β及β-actin抗體，以及羊抗兔過氧化物酶標(biāo)記IgG II 抗、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、PVDF膜、超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物、SDS-PAGE凝膠試劑盒、RIPA裂解液等購自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol總RNA抽提試劑盒、BeyoRTTMII M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)、Easy-LoadTMPCR Master Mix(Blue, 2×)和瓊脂糖購自碧云天生物技術(shù)有限公司；PCR引物設(shè)計與合成由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。BIO-EVF3 von Frey電子測痛儀(Bioseb)；DB026型冷熱板測量儀和DB020型熱刺痛儀(北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司)；FA2104S電子分析天平(上海光學(xué)儀器廠)；H2500R-2高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)； iMark酶標(biāo)儀、Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)、Mini-PROTEAN 3 Dodeca小型高通量電泳槽、Mini Trans-Blot Electrophoreti小型 Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽(濕轉(zhuǎn))、小型垂直電泳系統(tǒng)、Model 111 Mini IEF Cell等電聚焦電泳槽和SmartSpec Plus 核酸蛋白測定儀等(Bio-Rad)；DTC-3T型梯度PCR儀(上海金鵬分析儀器有限公司)。

2動物分組及給藥

將60只BALB/c小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照(control)組、完全弗氏佐劑炎性痛模型(model)組、陽性對照(CFA+Dex)組和白藜蘆醇高、中、低劑量(CFA+Res 100、50、25 mg/kg)組。正常對照組于小鼠右后足墊皮下注射生理鹽水20 μL，其余各組小鼠右后足墊皮下注射CFA 20 μL。造模后第7天，正常對照組和模型組小鼠生理鹽水10 mL/kg灌胃，陽性對照組小鼠地塞米松0.5 mg/kg灌胃，白藜蘆醇給藥組小鼠分別給予白藜蘆醇100、50和25 mg/kg灌胃，連續(xù)給藥7 d。

3主要方法

3.1von Frey纖維機械刺激縮足反射閾值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)的測定[9]將小鼠置于透明有機玻璃罩內(nèi)(高20 cm，直徑10 cm)，底部為金屬絲制成的網(wǎng)格墊(網(wǎng)格大小為5 mm×5 mm)，小鼠適應(yīng)10 min后開始檢測PWMT。操作方法如下：使用不同折力(g)的von Frey纖維絲刺激小鼠右足底皮膚，持續(xù)5～7 s，觀察小鼠有無抬足現(xiàn)象，若von Frey纖維彎曲至90 °時小鼠仍無抬足現(xiàn)象，則需用大一級的von Frey纖維再次刺激，若有明顯反應(yīng)，則用低一級的von Frey纖維刺激，每次刺激間隔時間為15 s，直到刺激能引起50%抬足反應(yīng)的von Frey纖維折力即為機械刺激縮足反射閾值，折力超過4.0 g按此值算。各組小鼠于造模前1 d 測定基礎(chǔ)機械縮足反射閾值，于造模后第7天(給藥前)及給藥后第1、3、5和7天測定小鼠機械刺激縮足反射閾值的變化。

3.2熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)的測定[9]將小鼠置于厚度為2 mm的玻璃板上，并調(diào)整其與熱刺痛儀適當(dāng)高度，用透明透氣塑料籠將小鼠固定在一定活動范圍內(nèi)，使其適應(yīng)15 min。將熱刺痛儀光輻射聚焦點對準(zhǔn)小鼠足底，打開開關(guān)，記錄從照射開始至小鼠出現(xiàn)縮足現(xiàn)象的時間(潛伏期)，如果照射時間超過20 s小鼠仍未出現(xiàn)縮足反應(yīng)，應(yīng)立即停止，避免灼傷足底。連續(xù)測定3次，每次間隔15 min，取平均值作為熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期。各組小鼠于造模前1 d測定基礎(chǔ)熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期，于造模后第7天(給藥前)及給藥后第1、3、5和7天測定小鼠熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期的變化。

3.3冷縮足反射次數(shù)(cold withdrawal times，CWT)的測定[9]將小鼠置于冷熱板測量儀上，調(diào)整板面溫度為(4±1) ℃，用透明透氣塑料籠控制其活動范圍，使其先適應(yīng)5 min，再記錄其5 min內(nèi)抬足、抖足或添足次數(shù)即為冷縮足反射次數(shù)。各組小鼠于造模前1 d測定基礎(chǔ)冷縮足反射次數(shù)，于造模后第7天(給藥前)及給藥后第1、3、5和7天測定小鼠冷縮足反射次數(shù)的變化。

3.4RT-PCR測定小鼠脊髓組織中NF-κB、IκBα、IKKβ、TNF-α及IL-1β的mRNA表達 小鼠末次給藥后完成行為學(xué)檢測后頸椎脫臼處死，快速取出小鼠L4～L6脊髓組織，勻漿后按照Trizol總RNA試劑盒說明書提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR擴增實驗。NF-κB的上游引物序列為5’-CAGCTTCACTCGGAGACTGG-3’，下游引物序列為5’-ACACGGAAGCTGGCTTTGTA-3’，產(chǎn)物314 bp；IκBα的上游引物序列為5’-GGGTGATTCGGCTGTTGTCT-3’，下游引物序列為5’-CCACTGAACACCTGGCTCTT-3’，產(chǎn)物231 bp；IKKβ的上游引物序列為5’-ACACCGTGACCGTTGACTAC-3’，下游引物序列為5’-CTTCTGCCGGACTTTGGAGT-3’，產(chǎn)物119 bp；TNF-α的上游引物序列為5’-CCTCTCATGCACCACCATCA-3’，下游引物序列為5’-GCATTGCACCTCAGGGAAGA-3’，產(chǎn)物184 bp；IL-1β的上游引物序列為5’-CTTTCCCGTGGACCTTCCAG-3’，下游引物序列為5’-AATGGGAACGTCACACACCA-3’，產(chǎn)物125 bp； β-actin的上游引物序列為5’-ACAGCAGTTGGTTGGAGCAAA-3’，下游引物序列為5’-CGCGACCATCCTCCTCTTA-3’，產(chǎn)物197 bp。PCR擴增條件為:94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA表達情況。

3.5Western bolt法檢測小鼠脊髓組織NF-κB p65、IκBα、IKKβ、TNF-α及IL-1β 蛋白的表達 小鼠末次給藥后完成行為學(xué)檢測后頸椎脫臼處死，快速取出小鼠L4～L6脊髓組織，于冰上充分勻漿，移入盛有RIPA裂解液的EP管中，按照說明書要求進行蛋白提取。用BCA法檢測各樣本總蛋白濃度，并調(diào)整一致，沸水中滅活蛋白5 min，行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，孵育相應(yīng) I 抗及 II 抗，加入ECL顯色液，于凝膠成像儀下顯影拍照，分析蛋白表達情況。

4統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1白藜蘆醇對炎性痛小鼠機械刺激縮足反射閾值的影響

與正常對照組比較，給予CFA 7 d后，模型組及各給藥組小鼠機械刺激縮足反射閾值明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，分別給予白藜蘆醇100和50 mg/kg后第3、5和7天，小鼠機械刺激縮足反射閾值明顯升高(P<0.05或P<0.01)，見圖1。

Figure 1. The effects of resveratrol (Res) on paw withdrawal mechaical threshold (PWMT) in the mice with inflammatory pain induced by complete Freund’s adjuvant (CFA). Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖1白藜蘆醇對炎性痛小鼠機械刺激縮足反射閾值的影響

2白藜蘆醇對炎性痛小鼠熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期的影響

與正常對照組比較，給予CFA 7 d后，模型組及各給藥組小鼠熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期明顯縮短(P<0.01)；與模型組比較，給予白藜蘆醇100 mg/kg后第1天及給予白藜蘆醇100和50mg/kg后第3、5和7天，小鼠熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期顯著延長(P<0.05或P<0.01)，見圖2。

Figure 2. The effects of resveratrol (Res) on paw withdrawal thermal latency (PWTL) in the mice with inflammatory pain induced by complete Freund’s adjuvant (CFA). Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖2白藜蘆醇對炎性痛小鼠熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期的影響

3白藜蘆醇對炎性痛小鼠冷縮足反射次數(shù)的影響

與正常對照組比較，給予CFA 7 d后，模型組及各給藥組小鼠冷縮足反射次數(shù)明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，給予白藜蘆醇100 mg/kg后第1天、給予白藜蘆醇100和50 mg/kg后第3、5和7天及給予白藜蘆醇25 mg/kg第7天，小鼠冷縮足反射次數(shù)顯著減少(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

Figure 3. The effects of resveratrol (Res) on cold withdrawal times (CWT) in the mice with inflammatory pain induced by complete Freund’s adjuvant (CFA). Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.05vsmodel group.

圖3白藜蘆醇對炎性痛小鼠冷縮足反射次數(shù)的影響

4白藜蘆醇對炎性痛小鼠脊髓組織NF-κB、IκBα、IKKβ、TNF-α及IL-1βmRNA表達的影響

與正常對照組比較，炎性痛模型組小鼠脊髓組織NF-κB、IκBα、IKKβ、TNF-α及IL-1β的mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，給予白藜蘆醇100 mg/kg可明顯下調(diào)炎性痛小鼠脊髓組織NF-κB、IκBα、IKKβ、TNF-α及IL-1β 的mRNA表達水平(P<0.05或P<0.01)，見圖4。

Figure 4. The effects of resveratrol (Res) on the mRNA expression levels of NF-κB, IκBα, IKKβ, TNF-α and IL-1β mRNA in the spinal cord tissues of the mice with inflammatory pain induced by complete Freund’s adjuvant (CFA). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖4白藜蘆醇對炎性痛小鼠脊髓組織NF-κB、IκBα、IKKβ、TNF-α及IL-1βmRNA表達水平的影響

5白藜蘆醇對炎性痛小鼠脊髓組織NF-κB、IκBα、IKKβ、TNF-α及IL-1β蛋白表達的影響

與正常對照組比較，炎性痛模型組小鼠脊髓組織NF-κB、IκBα、IKKβ、TNF-α及IL-1β 蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，給予白藜蘆醇100 mg/kg可顯著下調(diào)炎性痛小鼠脊髓組織NF-κB、IκBα、IKKβ、TNF-α及IL-1β 蛋白表達水平(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

Figure 5. The effects of resveratrol (Res) on the protein expression levels of NF-κB, IκBα, IKKβ, TNF-α and IL-1β in the spinal cord tissue of the mice with inflammatory pain induced by complete Freund’s adjuvant (CFA). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖5白藜蘆醇對炎性痛小鼠脊髓組織NF-κB、IκBα、IKKβ、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平的影響

討 論

炎性痛是由損傷或感染的組織或細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)(因子)所導(dǎo)致的機體感覺異常和痛覺功能障礙的一種慢性病理性疼痛，許多不明原因的疼痛疾患往往都是由于組織的炎癥所導(dǎo)致的，因此控制炎癥是緩解炎性痛的重要措施之一[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在100 mg/kg和50 mg/kg劑量時可明顯升高CFA致炎性痛小鼠機械刺激縮足反射閾值，顯著延長其熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期并減少其冷縮足反射次數(shù)，表明白藜蘆醇對炎性痛具有較好的緩解作用，可作為一種潛在的抗炎性痛藥物進行研究開發(fā)。

炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子在炎性痛的發(fā)生發(fā)展中扮演著非常重要的角色，當(dāng)機體受損或發(fā)生炎癥時，損傷或炎癥組織釋放或合成某些炎性介質(zhì)，通過直接或間接的作用，激活不同的受體使痛覺感受器興奮從而產(chǎn)生痛覺沖動并形成痛覺。有研究表明，IKKβ/IκBα/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是調(diào)控炎性痛發(fā)生發(fā)展的重要通路。在生理狀態(tài)下，NF-κB與IκB結(jié)合在一起，IκB為NF-κB抑制蛋白，覆蓋NF-κB核定位序列，使得NF-κB以無活性的形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受損或在炎癥因子和氧化劑等刺激下，胞漿內(nèi)IKK被激活，促進IκBα的第32和36位絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化并快速泛素化，使NF-κB從復(fù)合體中游離出來，其核定位序列得以暴露從而被激活，然后轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核內(nèi)，與DNA分子靶基因啟動子或增強子特定位點結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白(如TNF-α和IL-1β等)的生成[12]。另外，NF-κB誘導(dǎo)生成的細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1β等，又是NF-κB活化的刺激劑，可進一步激活NF-κB活性，使損傷和炎癥反應(yīng)持續(xù)放大，導(dǎo)致疼痛不斷延續(xù)和加重[13-16]。研究證實，在炎性痛組織中，NF-κB信號通路被持續(xù)激活，抑制其活性可有效緩解炎性痛癥狀[17]。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇100 mg/kg可明顯降低CFA誘導(dǎo)的炎性痛小鼠脊髓組織NF-κB、IκBα、IKKβ、TNF-α及IL-1β mRNA和蛋白表達水平，提示白藜蘆醇緩解CFA炎性痛的作用機制與抑制NF-κB信號通路有關(guān)，但其具體的作用靶基因或蛋白還有待進一步的實驗研究。

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