TTP減輕大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷*

陳朝暉， 洪溪屏， 蘭 頻， 潘 鋒

(麗水市中心醫(yī)院急診科， 浙江 麗水 323000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)作為一種危害極其嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其病死率和致殘率非常高，大約12.4%的患者在出血后立即死亡，50%左右的幸存者遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙[1-2]。近年來研究表明，早期腦損傷(early brain injury，EBI)是SAH患者出現(xiàn)急性神經(jīng)功能損害最主要的原因，腦細(xì)胞凋亡、腦水腫、炎性反應(yīng)和血腦屏障損傷是早期腦損傷關(guān)鍵的病理改變，自SAH發(fā)生起持續(xù)72 h[3-4]。Tristetraprolin (TTP)作為串聯(lián)CCCH(半胱氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-組氨酸)型鋅指蛋白家族的成員，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控白細(xì)胞介素(interleuklin，IL)-6、IL-33、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和低氧誘導(dǎo)因子α(hypoxia-inducible factor-α，HIF-α)等多種細(xì)胞因子的表達(dá)[5]，還參與了包括細(xì)胞分化、凋亡和癌變在內(nèi)的諸多病理生理過程[6]。但TTP在SAH中作用尚不明確，本研究旨在探討TTP在大鼠SAH后EBI中的作用機(jī)制，為臨床SAH的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康清潔級成年雄性SD大鼠116只， 體質(zhì)量290～340 g，購自中科院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號為SCXK(滬)2012-0002，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均依照“NIH Guidelines of Care and Use of Laboratory Animals (2011)”標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，動(dòng)物飼養(yǎng)于18～24 ℃恒溫恒濕環(huán)境中，12 h/12 h光暗周期，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)分為2部分，在第1部分實(shí)驗(yàn)中，56只大鼠經(jīng)隨機(jī)數(shù)字表法分為7組：sham組及SAH造模后0、12、24、48、72 h和1 周這6個(gè)時(shí)點(diǎn)組，每組8只；在第2部分實(shí)驗(yàn)中，60只大鼠被隨機(jī)分成sham組、SAH組、SAH+對照質(zhì)粒(vector)組和SAH+TTP組，每組15只，SAH+vector組和SAH+TTP組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在SAH建模前經(jīng)腦室注射對照質(zhì)粒和TTP過表達(dá)質(zhì)粒。在實(shí)驗(yàn)過程中，sham組大鼠無一例死亡，10只大鼠在SAH造模手術(shù)中死亡，死亡率為7.9%。

2主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

外科手術(shù)器械由華東醫(yī)藥公司提供；LKB-2088型冰凍切片機(jī)由LKB提供；垂直轉(zhuǎn)移電泳儀由Bio-Rad提供；組織勻漿儀器由Prosolution提供；自動(dòng)恒溫箱由山東菏澤生化儀器廠提供。

細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自TaKaRa；大鼠TTP基因過表達(dá)慢病毒載體及陰性對照載體購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司；ELISA試劑盒購自Bender MedSystems；抗TTP、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3和β-actin抗體購自Epitomics。

3方法

3.1大鼠SAH模型建立 參考Bederson等[7]的血管內(nèi)穿刺法制備大鼠SAH模型，應(yīng)用10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，置于實(shí)驗(yàn)臺上固定，頸部皮膚備皮并消毒后于頸部正中縱向切開，顯露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，用血管夾臨時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈切一個(gè)小口，自切口將導(dǎo)管和鎢絲插入頸外動(dòng)脈，將導(dǎo)管緩緩?fù)七M(jìn)至大腦前動(dòng)脈和中動(dòng)脈分叉處，將鎢絲繼續(xù)推進(jìn)1～2 mm，穿破動(dòng)脈建立SAH模型。Sham組大鼠進(jìn)行相似手術(shù)操作，但不穿破動(dòng)脈。手術(shù)結(jié)束后，將大鼠置于恒溫箱內(nèi)并標(biāo)記。慢病毒液在SAH建模前24 h通過立體定向儀經(jīng)右側(cè)側(cè)腦室注射。注射坐標(biāo)為：向后1.0 mm，右側(cè)旁開1.0 mm，深度為4.5 mm。慢病毒注射量為10 μL(濃度為1×1011TU/L)，注射完成后繼續(xù)留針5 min。

3.2IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的檢測 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行，分別檢測各組大鼠腦組織樣本中IL-6和TNF-α的水平，用酶標(biāo)儀測定650 nm波長處吸光度(A650)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

3.3神經(jīng)功能缺損的評價(jià) 在SAH造模48 h后根據(jù)Sugawara等[8]的評分方法對各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。改良Garicia評分標(biāo)準(zhǔn)包括：自發(fā)活動(dòng)、四肢對稱運(yùn)動(dòng)、前掌運(yùn)動(dòng)、攀爬能力、身體本體感受及胡須刺激反應(yīng)6個(gè)項(xiàng)目，每個(gè)項(xiàng)目0～3分，得分越高，表明神經(jīng)功能缺損越輕。

3.4腦組織含水量的測定 每組大鼠各取5只在造模48 h后處死，斷頭取全腦組織，擦去表面血跡后稱重(濕重)，然后將腦組織放置于110 ℃烤箱內(nèi)烘干72 h至恒重，并稱量其干重，計(jì)算腦組織含水量，腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.5腦血管通透性的測定 每組大鼠各取5只在處死前1 h經(jīng)尾靜脈注射2%的伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)溶液(5 mL/kg)，全身循環(huán)1 h后開胸，去除心臟包膜后暴露心臟，用輸液器針頭刺入左心室并插入升主動(dòng)脈，用彎鉗固定，用生理鹽水自左心室行心臟灌注，維持灌注壓在100 mmHg左右，待灌注液為清亮液體后斷頭取腦組織，將左、右半腦組織稱重后按10 mL/kg比例浸入甲酰胺溶液后勻漿，將勻漿液置入60 ℃恒溫水浴箱內(nèi)孵育24 h，待EB浸出后將浸出液于酶標(biāo)儀630 nm波長處測定吸光度(A630)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

3.6Western blot檢測蛋白的表達(dá) 取各組大鼠顳葉皮質(zhì)腦組織加入細(xì)胞裂解液中，置于冰上反應(yīng)30 min，4 ℃條件下以12 000 r/min離心20 min，收集上清后使用BCA蛋白檢測試劑盒對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量分析。蛋白質(zhì)樣品(30 μg)行10% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到0.45 μm的硝酸纖維素膜上，并使用5%脫脂奶粉于4℃下孵育過夜，該膜在4 ℃與 I 抗在室溫下反應(yīng)30min后，在室溫下與 II 抗再次孵育1 h。以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin蛋白條帶灰度值的比值來表示蛋白的相對表達(dá)量。

3.7TUNEL法檢測腦細(xì)胞凋亡 各組大鼠腦組織石蠟切片經(jīng)脫蠟水化，按TUNEL試劑盒說明書操作，切片經(jīng)3%過氧化氫室溫封閉15 min，滴加含0.1% Triton X-100的0.1%檸檬酸溶液于冰上反應(yīng)3 min，每個(gè)樣本滴加 50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，置于濕盒中37 ℃孵育1 h，再添加100 μg/L的DAPI核染8 min，置于熒光顯微鏡(OLYMPUS, BX51TF型)下選擇視野拍片，凋亡細(xì)胞核為綠色，凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)由一位對分組不了解的病理醫(yī)師觀察，每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組樣本均數(shù)之間比較采用單因素(one-way ANOVA)方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1TTP在SAH大鼠中的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，與sham組相比較，TTP在SAH造模術(shù)后12 h開始下降(P<0.01)，在SAH后48 h達(dá)到最低點(diǎn)，隨著時(shí)間的延續(xù)，SAH造模1周后，TTP開始表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，見圖1A；將慢病毒注射入大鼠腦室后，利用Western blot檢測TTP在各組大鼠腦組織中的表達(dá)，與SAH+vector組相比較，SAH+TTP組腦組織中TTP蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1B。

Figure 1. The changes of TTP protein expression in the brain tissues of SAH rats. A: the expression of TPP in the brain tissues after SAH determined by Western blot; B: the protein level of TTP in rat brains after transfected withTPPover-expression vector. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsSAH 0 h group;▲P<0.05vsSAH 48 h group;△△P<0.01vsSAH+vector group.

圖1SAH大鼠腦組織中TTP表達(dá)的變化

2TTP對大鼠SAH后EBI的影響

ELISA法分析IL-6和TNF-α在各組腦組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示， IL-6和TNF-α在SAH組大鼠腦組織中的表達(dá)較sham組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與SAH+vector組相比較，SAH+TTP組大鼠腦組織中IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著下降(P<0.05)，見圖2A、B。

如圖2C所示，與sham組相比較，SAH組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，Garcia評分顯著降低(P<0.01)；而SAH+TTP組大鼠神經(jīng)缺損評分顯著高于SAH+vector組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。

如圖2D所示， SAH建模48 h后大鼠腦組織含水率較sham組上升(P<0.01)；上調(diào)TTP在大鼠腦組織中的表達(dá)可顯著降低腦組織含水率，與SAH+vector組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

如圖2E所示，SAH組大鼠腦組織中EB滲出較sham組顯著增加(P<0.01)，表明SAH可增強(qiáng)腦血管通透性；而SAH+TTP組大鼠在SAH建模48 h后腦組織中EB含量低于SAH+vector組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 2. The effects of TTP on early brain injury following SAH in the rats. A and B: ELISA analysis was performed to evaluate the effect ofTTPover-expression on the levels of IL-6 and TNF-α in the brain tissues of SAH rats； C, D and E: the changes of neurological deficit score, brain water content and EB extravasation were also measured 48 h after SAH. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsSAH+vector group.

圖2TTP對大鼠SAH后EBI的影響

3TTP對大鼠SAH后腦細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL法檢測各組大鼠腦細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，SAH組大鼠腦細(xì)胞凋亡數(shù)較sham組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；過表達(dá)TTP可顯著減少SAH導(dǎo)致的腦細(xì)胞凋亡(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. Over-expression of TTP significantly inhibited the number of TUNEL-positive neural cells compared with SAH+vector group (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsSAH+vector group.

圖3TTP對大鼠SAH后腦細(xì)胞凋亡的影響

Western blot檢測結(jié)果表明，與sham組相比較，SAH建模48 h后大鼠腦組織中Bax的表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)上調(diào)cleaved caspase-3的水平，而Bcl-2的表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；上調(diào)TTP在腦組織中的表達(dá)可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)Bax和cleaved caspase-3的水平明顯下調(diào)(P<0.01)，見圖4。

討 論

SAH作為一種常見的出血性腦血管疾病，具有極大的危害性[1-2]。SAH后72 h內(nèi)可發(fā)生腦水腫、腦血管痙攣、炎性反應(yīng)、血腦屏障破壞和肺水腫等一系列并發(fā)癥，從而引發(fā)早期腦損傷，而腦水腫和血腦屏障的破壞是引起早期腦損傷最關(guān)鍵的病理生理反應(yīng)。研究表明早期腦損傷是導(dǎo)致SAH患者致死致殘的最主要原因。目前，大鼠SAH模型的建立有枕大池注血法、視交叉注血法和血管內(nèi)穿刺法3種[9]，而血管內(nèi)穿刺法更適合研究大鼠SAH后早期腦損傷，為此，本研究通過血管內(nèi)穿刺法建立大鼠SAH模型，觀察到假手術(shù)組大鼠術(shù)后蛛網(wǎng)膜下腔未見明顯出血及血凝塊，而SAH造模后在顱底腦組織表面可見大量彌漫性出血及血凝塊，包繞腦底部主要血管。既往研究表明，SAH后引起腦細(xì)胞炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)在導(dǎo)致腦水腫和腦細(xì)胞凋亡反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。在顱內(nèi)壓增加和腦血流減少的雙重影響下，外周免疫細(xì)胞滲入腦組織并釋放大量促炎因子，這些促炎因子不僅損傷周圍腦細(xì)胞，同時(shí)損傷神經(jīng)細(xì)胞并導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生，本次研究也觀察到大鼠SAH后可誘導(dǎo)諸如IL-6和TNF-α在腦組織中的表達(dá)，與既往研究相仿[10]。

TTP作為一種當(dāng)今研究得較為透徹的富含AU元件(AU-rich elements，AREs)結(jié)合蛋白，可通過有效降解炎癥和腫瘤相關(guān)基因mRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控機(jī)體多種病理生理反應(yīng)[5-6]。近年來，越來越多證據(jù)表明TTP在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮了一定作用。研究表明，TNF-α、IL-6和GM-CSF等多種mRNA在特異性沉默TTP的裸鼠體內(nèi)保持穩(wěn)定狀態(tài)，同時(shí)這些炎癥相關(guān)因子的過度表達(dá)導(dǎo)致裸鼠惡液質(zhì)、侵蝕性關(guān)節(jié)炎、皮膚炎、結(jié)膜炎和腎小球腎炎等多種炎癥反應(yīng)；另外改變TTP在機(jī)體中的表達(dá)對諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡和潰瘍性結(jié)腸炎等疾病的發(fā)生和嚴(yán)重程度起到非常重要的作用[10-13]。但目前尚未有TTP與SAH的相關(guān)性研究報(bào)道，在本研究中，我們觀察到TTP在SAH造模后12 h即開始表達(dá)下調(diào)，在48 h達(dá)到最低值，表明TTP有可能作為SAH后EBI發(fā)生的早期預(yù)測因子及治療靶點(diǎn)。為進(jìn)一步研究TTP在大鼠SAH中的作用，我們通過慢病毒干擾技術(shù)上調(diào)大鼠腦組織中TTP的表達(dá)，功能性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)TTP不僅可抑制促炎因子在大鼠SAH后腦組織中的表達(dá)，同時(shí)首次觀察到TTP可有效改善SAH后腦水腫、神經(jīng)功能缺損和腦血管通透性增加等EBI表現(xiàn)，從而表明TTP作為SAH治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。

Figure 4. Over-expression of TTP markedly decreased the levels of cleaved caspase-3 and Bax, and elevated the diminished level of Bcl-2. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsSAH+vector group.

圖4Westernblot檢測TTP對大鼠腦細(xì)胞中Bax、Bcl-2和cleavedcaspase-3水平的影響

細(xì)胞凋亡作為一種細(xì)胞程序性死亡方式，在SAH后早期腦損傷中扮演著重要角色，凋亡細(xì)胞可通過釋放諸如TNF-α和IL-6等炎性因子從而影響周圍正常細(xì)胞發(fā)生壞死，因此，抑制SAH后腦細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是SAH治療策略中重要的一環(huán)[14]。Caspase-3作為一種在凋亡線粒體通路和死亡受體通路中均發(fā)揮作用的關(guān)鍵蛋白酶，被稱為細(xì)胞凋亡發(fā)生的執(zhí)行者[15]。在本研究中，SAH可誘導(dǎo)大鼠腦細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)caspase-3的活化形式cleaved caspase-3在腦細(xì)胞中的表達(dá)，而TTP不僅可有效抑制SAH誘導(dǎo)產(chǎn)生的腦細(xì)胞凋亡，還能抑制caspase-3的活化，從而表明抑制腦細(xì)胞凋亡在TTP的SAH后腦細(xì)胞保護(hù)作用中扮演了重要角色。研究表明促凋亡蛋白Bax可通過編碼產(chǎn)物從而使得抗凋亡蛋白Bcl-2失活，從而在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[16]。在本研究中，過表達(dá)TTP可抑制Bax在腦細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，表明降低Bax/Bcl-2比值在TTP發(fā)揮腦細(xì)胞保護(hù)作用中可能起到關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究表明TTP可有效保護(hù)大鼠SAH后早期腦損傷的發(fā)生，同時(shí)抑制腦細(xì)胞凋亡，其抑制腦細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與降低Bax/Bcl-2比值有關(guān)，但TTP是否對體外神經(jīng)元細(xì)胞具有保護(hù)作用尚未可知，同時(shí)TTP發(fā)揮SAH后腦細(xì)胞保護(hù)作用的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確，另外TTP在本次實(shí)驗(yàn)造模晚期出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，可能與機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。但本次研究為臨床SAH治療提供一個(gè)新的作用靶點(diǎn)，在揭示SAH的發(fā)病機(jī)制及治療上具有一定積極意義。

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