苦豆堿對(duì)缺血再灌注引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷和炎癥應(yīng)答的作用

張會(huì)超， 徐 里， 芮浩淼， 曹程浩， 楊鳳鳴， 袁 彬

(1河南省中醫(yī)院， 河南 鄭州 450002； 2河南中醫(yī)藥大學(xué)， 河南 鄭州 450008)

心肌梗死是常見的缺血性心臟病之一，具有較高的發(fā)病率和致死率，已成為影響人類健康的重要?dú)⑹帧Ｔ诮?jīng)手術(shù)治療恢復(fù)血流的過程中，常會(huì)觸發(fā)心肌的缺血再灌注(ischemic reperfusion，I/R)損傷，從而引起心肌細(xì)胞的凋亡，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，造成心力衰竭和心律失常等臨床上常見問題，嚴(yán)重影響治療效果，是目前心腦血管研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題[1]?？喽箟A(aloperine，Alo)是從中藥苦豆子中分離出來的一種生物堿，具有抗炎、抗腫瘤及抗感染的功效[2]。大量研究表明，苦豆堿能夠減緩慢性壓迫性損傷引起的神經(jīng)疼痛，保護(hù)氧糖剝奪再灌注引起的海馬神經(jīng)元損傷[3-4]。近期研究證實(shí)，苦豆堿可以保護(hù)缺血再灌注誘發(fā)的急性腎損傷[5]。但是，苦豆堿是否可以保護(hù)缺血再灌注損傷的心肌尚不清楚。因此，本研究通過體外缺氧/復(fù)氧方法來模擬缺血再灌注(simulated ischemia-reperfusion，SI/R)損傷，分析苦豆堿對(duì)SI/R引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷及炎性應(yīng)答的影響，并探討可能的作用機(jī)制，從而進(jìn)一步為心肌缺血再灌注損傷防治提供新的治療策略。

材 料 和 方 法

1材料

大鼠H9c2胚胎心肌細(xì)胞株購自ATCC?？喽箟A購自上海邦景實(shí)業(yè)有限公司(純度>99%)；新生牛血清(華美生物工程有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazo-lium bromide，MTT]和PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002購自Sigma；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒購自BioVision；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物制品研究所；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；抗大鼠p-PI3K p85、PI3K p85、p-AKT、AKT、Bcl-2和Bax抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 II 抗均購自Abcam；檢測(cè)白細(xì)胞介素(intreleukin，IL)-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-1β的ELISA試劑盒購自Abcam。

2主要方法

2.1心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 將H9c2細(xì)胞置于高糖DMEM完全培養(yǎng)集中培養(yǎng)(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)，所有細(xì)胞均在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。

2.2體外心肌細(xì)胞缺血再灌注模型的構(gòu)建 采用缺氧/復(fù)氧的方法體外模擬體內(nèi)心肌細(xì)胞I/R，即用DMEM培養(yǎng)基(不含糖和血清)培養(yǎng)細(xì)胞，并將其置于含95% N2和5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中模擬缺氧環(huán)境，即對(duì)照組(control組)；孵育10 h后置換含糖及血清的DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱(95% O2和5% CO2)中復(fù)氧，繼續(xù)孵育4 h，即SI/R組。此外，設(shè)置苦豆堿處理(SI/R+Alo)組，即分別加入不同濃度的苦豆堿(20、50和100 mg/L)處理不同時(shí)間(8、12、24和48 h)后行SI/R；同時(shí)設(shè)置SI/R+ALo+LY294002(25 μmol/L)組。

2.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率 分別將500 μL細(xì)胞(2×107/L)接種于96孔培養(yǎng)板中，按上述條件處理后置換DMEM培養(yǎng)基，加入20 μL MTT(5 g/L)繼續(xù)孵育4 h；按每孔150 μL加入DMSO以充分溶解結(jié)晶產(chǎn)物。將樣品置于酶標(biāo)儀上，測(cè)定490 nm處的吸光度(A)，每孔重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

2.4檢測(cè)細(xì)胞上清中LDH和MDA的水平 收集不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)液，4 ℃、5 000×g離心 15 min，收集上清。按照試劑盒說明書分析細(xì)胞上清中LDH和MDA的水平。

2.5Annexin V/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用Annexin V/PI雙重染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集不同處理組的細(xì)胞，PBS洗滌3次；加入配制好的結(jié)合緩沖液(250 μL)重懸細(xì)胞，調(diào)整至密度為1×109/L；將100 μL上述細(xì)胞懸液接種至5 mL流式管；加入Annexin V/FITC(5 μL)和 PI(10 μL)染色，室溫下避光孵育；15 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.6Caspase-3的活性分析 將不同處理組細(xì)胞收集后離心棄上清，加入細(xì)胞裂解液，冰上孵育15 min；12 000×g、4 ℃離心機(jī)離心；15 min后收集上清，按照caspase-3活性分析試劑盒說明書步驟于波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定A值，根據(jù)制備的標(biāo)注曲線評(píng)估caspase-3活性。

2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 收集不同處理組細(xì)胞，RIPA裂解液處理細(xì)胞，離心后采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將等量樣本處理后，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)束后采用半干轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將含有目的蛋白的NC膜用5%的脫脂奶粉封閉1.5 h；加入抗Bcl-2、Bax、p-PI3K p85、PI3K p85、p-AKT和AKT 的 I 抗，4 ℃過夜；TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗，繼續(xù)孵育1 h；用顯影液ECL處理1 min，以β-actin為內(nèi)參照放射自顯影分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。采用GS-800成像系統(tǒng)掃描圖像，ImageJ定量分析條帶灰度值。

2.8ELISA分析炎癥因子的表達(dá)水平 收集不同處理組上清，采用ELISA法檢測(cè)炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平，具體操作按照ELISA試劑盒操作說明書進(jìn)行。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1苦豆堿對(duì)SI/R處理的H9c2心肌細(xì)胞損傷的影響

SI/R處理后，H9c2心肌細(xì)胞的存活率較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；當(dāng)用苦豆堿預(yù)處理后，SI/R處理的心肌細(xì)胞的存活率明顯增加，且在Alo 100 mg/L時(shí)效果最強(qiáng)(P<0.05)，見圖1A；隨著苦豆堿作用時(shí)間的增加，SI/R受損的心肌細(xì)胞的存活率呈上升趨勢(shì)，且在24 h和48 h時(shí)效果最強(qiáng)(P<0.05)，見圖1B。因此本研究選取100 mg/L苦豆堿作用24 h的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行后續(xù)分析。此外，苦豆堿可顯著降低SI/R增加的LDH活性(P<0.05)及MDA含量(P<0.05)，見圖1C、D。

Figure 1. The effects of aloperine (Alo) on cardiomyocyte injury under SI/R condition. A: the viability of H9c2 cells treated with Alo at various doses; B: the viability of H9c2 cells treated with Alo for various time; C: the changes of LDH activity; D: the changes of MDA level. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSI/R group.

圖1苦豆堿對(duì)SI/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

2苦豆堿抑制SI/R誘發(fā)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)分析表明，SI/R處理明顯誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡(P<0.05)，而苦豆堿(100 mg/L)處理可顯著抑制細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)，見圖2A；此外，苦豆堿可顯著降低SI/R增加的caspase-3活性(P<0.05)，見圖2B。SI/R處理后，H9c2心肌細(xì)胞中Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05)，而苦豆堿能夠顯著增加Bcl-2/Bax比值(P<0.05)，見圖2C。

3苦豆堿對(duì)SI/R處理的H9c2心肌細(xì)胞促炎性因子水平的影響

ELISA分析證實(shí)，與對(duì)照組相比，SI/R處理后H9c2心肌細(xì)胞中促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的濃度顯著增加(P<0.05)，而苦豆堿作用后，IL-6、TNF-α和IL-1β的濃度均較SI/R組明顯降低(P<0.05)，提示苦豆堿可顯著降低SI/R誘發(fā)炎性因子的水平，見圖3。

4苦豆堿對(duì)SI/R作用下H9c2心肌細(xì)胞中PI3K/AKT通路的影響

與對(duì)照組相比，SI/R處理后H9c2心肌細(xì)胞中p-PI3K p85和p-AKT的蛋白水平有不同程度的升高(P<0.05)，當(dāng)用苦豆堿作用后，細(xì)胞中p-PI3K p85和p-AKT的蛋白水平進(jìn)一步升高(P<0.05)，提示苦豆堿能夠加強(qiáng)SI/R作用下H9c2心肌細(xì)胞中PI3K/AKT通路的活化，見圖4。

Figure 2. The effects of aloperine (Alo) on the cardiomyocyte apoptosis under SI/R condition. A: the cell apoptosis detected by flow cytometry; B: the changes of caspase-3 activity; C: the protein expression of Bcl-2 and Bax determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSI/R group.

圖2苦豆堿對(duì)SI/R處理的心肌細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3. The effects of aloperine (Alo) on the levels of inflammatory cytokines in the H9c2 cells with SI/R. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSI/R group.

圖3苦豆堿對(duì)SI/R處理的心肌細(xì)胞炎性因子水平的影響

5苦豆堿通過激活PI3K/AKT通路減輕SI/R引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷及炎癥水平

與SI/R+Alo組相比，采用LY294002處理后，H9c2細(xì)胞中p-AKT的蛋白水平明顯降低(P<0.01)，見圖5A；阻斷PI3K/AKT通路后，苦豆堿上調(diào)的細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)，見圖5B；同時(shí)苦豆堿發(fā)揮的抗SI/R心肌細(xì)胞的凋亡能力顯著下降(P<0.05)，見圖5C；此外，苦豆堿下調(diào)的促炎因子水平也明顯上升(P<0.05)，見圖5D。

討 論

心肌缺血恢復(fù)血流供應(yīng)后造成的再灌注損傷能夠引起心律不齊和心力衰竭等問題，是目前臨床上影響缺血性心血管疾病治療效果不理想的關(guān)鍵原因。大量研究已證實(shí)苦豆堿在抗炎、抗腫瘤、保護(hù)海馬神經(jīng)元損傷及腎臟的I/R中起重要作用[2, 4-5]。但是，苦豆堿對(duì)心肌I/R的作用及機(jī)制尚不明確。

Figure 4. The effects of aloperine (Alo) on the protein levels of PI3K/AKT pathway-related molecules in the H9c2 cells with SI/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSI/R group.

圖4苦豆堿對(duì)SI/R細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

Figure 5. The effects of PI3K/AKT pathway on the protective role of aloperine in attenuating injury and inflammation in the H9c2 cells with SI/R. A: the effect of LY294002 on the protein levels of AKT and p-AKT; B～D: the effect of LY294002 on the viability (B), apoptosis (C) and inflammatory cytokine levels (D) in aloperine (Alo)-treated cells with SI/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSI/R group;#P<0.05，##P<0.01vsSI/R+Alo group.

圖5PI3K/ATK通路參與苦豆堿介導(dǎo)的SI/R心肌細(xì)胞損傷及炎癥應(yīng)答

已知H9c2細(xì)胞具有與原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞類似的功能，因此，本研究通過缺氧/復(fù)氧處理H9c2細(xì)胞來模擬體內(nèi)心肌I/R損傷，從而探討苦豆堿對(duì)心肌I/R的作用及機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦豆堿能夠提高SI/R抑制的H9c2心肌細(xì)胞的存活率。已有研究證實(shí)，缺血再灌注損傷能夠引起心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致LDH等釋放進(jìn)入血液中，可以從一個(gè)方面反映出心肌的壞死程度[6-7]。此外，該過程中活性氧的增多會(huì)進(jìn)一步加重心肌的損傷，其中MDA是常見的評(píng)估氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)記分子[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，苦豆堿作用后能夠抑制SI/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞中LDH及MDA的水平。此外，苦豆堿還可明顯抑制SI/R處理引起的H9c2心肌細(xì)胞的凋亡，降低caspase-3的活性，同時(shí)增加抗凋亡分子Bcl-2的水平。因此，這些結(jié)果提示苦豆堿具有減輕缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞損傷的作用。

越來越多的研究表明，缺血后心臟功能的損傷及細(xì)胞壞死程度與體內(nèi)促炎因子的水平直接相關(guān)，炎癥反應(yīng)能夠加重缺血再灌注后組織的損傷及凋亡[6, 9-10]。心臟缺血再灌注后伴隨有IL-6、TNF-α和IL-1β等促炎因子釋放的增加，從而引起大量炎性細(xì)胞聚集，造成血管堵塞、管腔狹窄和心肌細(xì)胞凋亡，其中，TNF-α高表達(dá)與心力衰竭程度、心肌梗塞等密切相關(guān)[11-12]。此外，大量研究證實(shí)，抑制心肌細(xì)胞的凋亡及炎癥應(yīng)答能夠減緩心肌的I/R損傷進(jìn)程[13-14]。與前期研究一致，體外SI/R處理后，H9c2心肌細(xì)胞中炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平明顯增加[12]。更為重要的是，苦豆堿處理能夠明顯抑制上述炎性因子的釋放，提示苦豆堿有可能通過抑制炎癥應(yīng)答來減緩心肌I/R損傷。

為進(jìn)一步探討苦豆堿抑制SI/R引起的心肌細(xì)胞損傷及炎性應(yīng)答的作用機(jī)制，本研究探討了PI3K/AKT通路在該過程中的作用。大量研究證實(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路可參與包括心肌和腎臟在內(nèi)的多種缺血再灌注損傷的修復(fù)進(jìn)程[11, 13, 15]。當(dāng)激活PI3K/AKT通路后，缺血再灌注引起的心肌凋亡及炎癥應(yīng)答均受到抑制，從而對(duì)抗心肌的I/R損傷，減少心肌的壞死及保護(hù)心臟功能[12, 14, 16-17]。在缺血再灌注的條件下，受損心肌細(xì)胞中PI3K/AKT通路被激活，在心肌的損傷應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[12]。本研究也證實(shí)，SI/R處理下，PI3K/AKT被適度激活。但是，該過程中PI3K/AKT的激活顯示出一定程度的增加，但不能大量活化，這也許是導(dǎo)致缺血再灌注條件下機(jī)體自身無法完全修復(fù)心肌損傷的原因。在糖尿病大鼠中，大量激活PI3K/AKT也能夠減緩I/R誘導(dǎo)的心肌凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予苦豆堿處理可明顯提高H9c2心肌細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，而LY294002處理可明顯抑制上述進(jìn)程。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/AKT通路后，苦豆堿促進(jìn)的SI/R心肌細(xì)胞存活率降低，同時(shí)其發(fā)揮的抑制心肌細(xì)胞凋亡及炎性因子水平的作用明顯減弱。因此，上述結(jié)果提示PI3K/AKT可能參與苦豆堿發(fā)揮的抗心肌I/R損傷進(jìn)程。

綜上所述，苦豆堿可通過激活PI3K/AKT通路發(fā)揮抗SI/R引起的心肌細(xì)胞損傷及炎癥應(yīng)答。因此，本研究提示苦豆堿有可能通過抑制心肌細(xì)胞凋亡及炎癥應(yīng)答對(duì)缺血再灌注損傷條件下的心肌起保護(hù)作用。

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