和肽素水平對(duì)大鼠心腎綜合征的早期預(yù)測價(jià)值*

盛曉生， 林 麗， 丁明星， 郭方明， 俞章平， 蔣李珍， 華 仙， 方遠(yuǎn)書

(1金華市人民醫(yī)院心內(nèi)科， 2金華市人民醫(yī)院麻醉科， 3金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 4金華市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 浙江 金華 321000)

心腎綜合征(cardiorenal syndrome，CRS)是指患者同時(shí)存在心功能不全和腎損害，且兩者之間存在復(fù)雜相互作用的臨床綜合征[1]。CRS包括不同的心臟和腎臟的病理生理障礙，任一器官的急、慢性功能障礙均可導(dǎo)致另一器官的急慢性功能障礙，兩者互為臨床發(fā)病危險(xiǎn)因素，相互加重導(dǎo)致心腎功能急劇惡化而增加死亡率，因而尋求早期特異和敏感的生物標(biāo)志物預(yù)測“心腎共損”，極為迫切[2]。和肽素(copeptin，CPP)是精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)原C末端的一部分，在體內(nèi)穩(wěn)定，便于檢測，已發(fā)現(xiàn)其在急性心肌梗死等心腦血管疾病的早期診斷及預(yù)后判斷方面有重要的臨床價(jià)值[3-4]，但與CRS發(fā)病及診療的相關(guān)研究較少，尤其缺乏動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)。因此，本項(xiàng)目應(yīng)用部分腎切除術(shù)(subtotal nephrectomy，SNX)合并心肌梗死(myocardial infarction，MI)的合并術(shù)式(SNX+MI)加重臟器損傷來建立CRS大鼠模型，觀察血漿及尿液中CPP濃度的動(dòng)態(tài)變化，并與腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)等指標(biāo)對(duì)比分析以評(píng)價(jià)CPP水平對(duì)CRS大鼠的預(yù)測價(jià)值，為尋找對(duì)CRS的診斷及預(yù)后的新標(biāo)志物提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

雄性SD大鼠60只，體重250～280 g，SPF級(jí)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002，合格證號(hào)為0278317。BP-300型大鼠應(yīng)用尾靜脈無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)購自成都泰盟軟件有限公司。血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)測試盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；肌酐測定試劑盒(寧波瑞源生物科技有限公司)；CPP和BNP ELISA試劑盒(USCN)。

2方法

2.1動(dòng)物造模及分組 60只實(shí)驗(yàn)大鼠在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)6 d后，采用隨機(jī)抓取方法(進(jìn)行數(shù)字編號(hào)，從每窩中隨機(jī)抓取2只放入1組)共分4組(每組15只)，包括空白對(duì)照(blank control，Con)組、腎衰組(SNX組)、心衰組(MI組)和心衰+腎衰組(CRS組)，按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法采用復(fù)合術(shù)式建模[5]?？瞻讓?duì)照組進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)，不做任何其余處理。SNX組用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后，打開腹腔，結(jié)扎左側(cè)腎臟腎動(dòng)脈、腎靜脈和輸尿管后，切除左側(cè)5/6腎臟，關(guān)閉腹腔，術(shù)后3 d肌注10萬單位青霉素鈉抗感染。MI組用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后， 肢體Ⅱ?qū)?lián)監(jiān)測ECG；口鼻部戴自制呼吸面罩，連接呼吸機(jī)維持呼氣末正壓呼吸(呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為呼吸頻率55～60次/分，呼吸比為1∶2，潮氣量為20 mL/kg)；左側(cè) 3、4肋間開胸器撐開開胸，暴露心臟， 左心耳下緣2～3 mm處進(jìn)針， 深度1.5～2 mm，寬度2～3 mm，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈主干；肉眼觀察左心室壁變白，ECG QRS波形變高變寬，S波與T波交點(diǎn)(J點(diǎn))明顯抬高，或者出現(xiàn)R波消失，呈典型QS波形時(shí)，提示結(jié)扎成功；術(shù)后3 d肌注10萬單位青霉素鈉抗感染。CRS組切除左側(cè)5/6腎臟并結(jié)扎冠狀動(dòng)脈建模。所有的實(shí)驗(yàn)程序按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批準(zhǔn)協(xié)議進(jìn)行。

2.2心功能與血壓(blood pressure，BP)評(píng)估 各組大鼠于造模后9 d和第5周處死前，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后，頸部正中縱行切開2 cm切口，暴露右頸總動(dòng)脈，PE50導(dǎo)管插管至左心室，采用生物信號(hào)處理系統(tǒng)分析心功能參數(shù)[心率(heart rate，HR)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)等]的變化。各組大鼠應(yīng)用尾靜脈無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)測量BP的變化，每周1次，共5次。

2.3腎功能評(píng)價(jià) 建模成功后，通過大鼠眼眶取血，收集尿液，每周1次，共5次，進(jìn)行腎功能檢測。應(yīng)用BUN測試盒以生化法檢測血清中各組大鼠BUN的水平；應(yīng)用肌酐測定試劑盒以肌氨酸氧化酶法檢測各組大鼠血清及尿液中的肌酐水平。

2.4ELISA檢測CPP和BNP水平 建模成功后，眼眶取血及收集尿液，每周1次，共5次。分別采用CPP和BNP ELISA試劑盒按照試劑盒說明操作，檢測各組大鼠血清及尿液中CPP和BNP水平。

2.5心和腎的組織學(xué)觀察 分別于建模后第9天和第5周殺死大鼠，取心和腎組織進(jìn)行常規(guī)HE染色切片組織光鏡檢查，以確認(rèn)CRS大鼠心和腎組織病理形態(tài)的改變。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)；正態(tài)分布資料的相關(guān)分析采用Pearson直線相關(guān)，非正態(tài)分布資料的相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)。應(yīng)用受試者工作特征 (receiver operating characteristic, ROC)曲線確定CPP、BNP及BUN對(duì)CRS的早期診斷價(jià)值。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1各組大鼠心功能和血壓的變化

血流動(dòng)力學(xué)檢測結(jié)果顯示，與Con組相比，SNX組大鼠的LVEDP在9 d時(shí)顯著升高(P<0.05)，MI組大鼠LVSP在9 d時(shí)顯著降低，LVEDP顯著升高(P<0.05)，CRS組大鼠LVSP在9 d時(shí)顯著降低，LVEDP顯著升高(P<0.05或P<0.01)。血壓檢測結(jié)果示，與Con組比，SNX組大鼠的收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)和平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)在1周時(shí)顯著降低(P<0.05)，MI組大鼠的SBP、DBP和MAP在3周時(shí)顯著降低(P<0.05)，而CRS組大鼠的SBP、DBP和MAP在各時(shí)點(diǎn)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表1。

2各組大鼠腎功能的變化

與Con組比，SNX組在造模后3周BUN顯著升高(P<0.05)， CRS組在造模后1和3周BUN顯著升高(P<0.05)；與Con組相比，SNX組大鼠的血清肌酐(serum creatinine，SCr)在造模3周顯著升高(P<0.05)，尿肌酐(urinary creatinine，UCr)在1周、3周時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P<0.05)，MI組大鼠的UCr在1周時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P<0.05)，CRS組大鼠的UCr在1周、3周時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)和血壓的變化

*P<0.05，**P<0.01vsCon group.

表2 各組大鼠第1、3周腎功能的變化

*P<0.05，**P<0.01vsCon group.

3CPP與BNP水平的變化及其與其它指標(biāo)的關(guān)系

與Con組相比，SNX組在造模3和5周血清和尿液中CPP均顯著升高(P<0.05)；MI組在造模后3周血清中CPP顯著升高(P<0.05)；CRS組在造模后1、3和5周血清中CPP顯著升高(P<0.05)，造模后3周尿液中CPP顯著升高(P<0.05)，見表3。同時(shí)，與Con組相比，SNX組在造模后1和3周血清中BNP顯著升高(P<0.05)，造模后5周尿液中BNP顯著升高(P<0.05)；MI組在造模后1、3和5周尿液中BNP顯著升高(P<0.05)；CRS組在造模后1和3周血清中BNP顯著升高(P<0.05)，造模后5周尿液中BNP顯著升高(P<0.05)，見表4。

相關(guān)分析顯示，CRS組在造模后1周血清中CPP與BNP和BUN無相關(guān)性(r分別為0.109和0.683，P>0.05)，尿液中CPP與BNP和BUN亦無相關(guān)性(r分別為-0.342和0.293，P>0.05)。

表3 各組大鼠CPP水平的變化

*P<0.05vsCon group.

表4 各組大鼠BNP水平的變化

*P<0.05vsCon group.

4CPP與BNP水平對(duì)CRS的早期診斷價(jià)值

選取各模型組血清CPP(sCPP)及尿液 CPP(uCPP)與BNP在造模后1周和3周的檢測結(jié)果為檢驗(yàn)變量，以組別為狀態(tài)變量，定義SNX組和MI組為組別0、CRS組為組別1，進(jìn)行ROC曲線分析。結(jié)果顯示，上述各指標(biāo)檢測診斷CRS時(shí)，sCPP在1周時(shí)的曲線下面積(area under the curve，AUC)為 0.908(95% CI為0.789～1.028)，以56.59 ng/L為閾值，其診斷敏感性為87.5%，特異性為80.0%。而sCPP在3周及 uCPP 與BNP在1和3周的檢測結(jié)果顯示，在相應(yīng)的閾值下的AUC及其診斷敏感性與特異性均低，無診斷價(jià)值，見圖1、表5。

Figure 1. ROC curves of serum CPP (sCPP), urinary CPP (uCPP) and BNP in the diagnosis of CRS. A: at 1 week, the areas under the curve (AUC) of sCPP, uCPP and BNP were 0.908， 0.475 and 0.617， respectively. B: at 3 weeks, the AUC of sCPP, uCPP and BNP were 0.489, 0.422 and 0.489， respectively.

圖1血清CPP及尿液CPP與BNP診斷CRS的ROC曲線

表5 血清及尿液CPP與BNP診斷CRS的ROC曲線分析

5各組大鼠心和腎的組織病理學(xué)改變

心臟組織 HE 染色顯示，CK組未見明顯的病理改變，SNX組、MI組和CRS組均見心肌組織紊亂，少數(shù)心肌變性、溶解及斷裂，毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張，以CRS組最為明顯，見圖2A。腎臟 HE 染色顯示，CK組無明顯病理改變，SNX組和MI組可見輕度損傷，CRS組最為嚴(yán)重，見圖2B。

Figure 2. Pathological changes of the cardiac (A) and renal (B) tissues in each group at 5 weeks (HE staining， ×200).

圖2各組大鼠第5周時(shí)心和腎的組織病理學(xué)改變

討 論

本研究證實(shí)，SNX+MI的合并術(shù)式加重臟器損傷，可用于建立CRS大鼠模型。該模型能體現(xiàn)心腎的雙向互動(dòng)作用，可以用來評(píng)估CRS的診療效應(yīng)。通過造模后1～5周動(dòng)態(tài)觀察血清及尿液中CPP濃度的變化，證實(shí)檢測CRS大鼠血清CPP水平有助于早期發(fā)現(xiàn)心腎并損程度，從而起到預(yù)警作用。CPP可以作為CRS早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，具有較高的敏感性和特異性。

近來隨著CRS概念的提出，心腎疾病之間的關(guān)系已被廣泛關(guān)注，臨床上進(jìn)一步的研究迫切需要穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型。CRS的大鼠模型最早始于2004年，采用心肌梗死術(shù)合并單側(cè)腎切除術(shù)，但該模型未觀察出心功能伴隨腎功能減退的進(jìn)行性損傷[6]。而本文采用的SNX+MI方法由Entin-Meer等[7]在CRS模型研究中創(chuàng)建，通過部分腎切除術(shù)合并心肌梗死術(shù)造模顯示出其優(yōu)勢，能體現(xiàn)心腎的雙向互動(dòng)作用。本項(xiàng)目中，我們采用大鼠造模后1～5周血液動(dòng)力學(xué)、血壓及腎功能指標(biāo)的動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)造模后1周即出現(xiàn)心腎功能的減退，提示大鼠在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)心腎功能的共損和互損，因而該模型能高度模擬臨床CRS的病變特點(diǎn)，可為CRS 的病理生理機(jī)制與藥物研究提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法。部分腎切除術(shù)后腎功能已有損傷的大鼠，其心肌更容易缺血損傷，尿毒癥大鼠的心肌梗死面積明顯增加，這與臨床上腎臟疾病患者并發(fā)心梗死亡率更高的特點(diǎn)一致。由于部分腎切除，腎分泌的紅細(xì)胞生成素減少，血氧容量下降，心臟射血加劇，心臟及各組織器官回血量增加，血管收縮，加重心肌肥厚，并引發(fā)血壓升高，內(nèi)皮損傷導(dǎo)致冠脈營養(yǎng)功能下降，加重心肌缺血。同時(shí)，心臟功能障礙反過來會(huì)加速腎臟固有損傷[8]。

CRS的發(fā)生會(huì)伴有不同的生物學(xué)標(biāo)志物的相應(yīng)改變，對(duì)其早期診斷、危險(xiǎn)評(píng)估、判斷預(yù)后有重要意義。因容量負(fù)荷及鈉潴留，心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)、AVP)原和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的不適當(dāng)激活，CRS導(dǎo)致機(jī)體水代謝紊亂更為突出。其中AVP系統(tǒng)可能是除RAS和交感神經(jīng)系統(tǒng)以外，另一個(gè)與急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)或心力衰竭預(yù)后不良密切相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)[9]。CPP檢測方便易行，結(jié)果穩(wěn)定，可在各級(jí)醫(yī)院開展，可取代對(duì)AVP的直接測量。本項(xiàng)目在造模后1～5周動(dòng)態(tài)檢測血清和尿液中CPP濃度的變化，發(fā)現(xiàn)CRS組在造模后1 周和3周血清和尿液中CPP顯著升高，造模后5周僅血清中升高，ROC曲線分析顯示造模后1周血清CPP預(yù)測CRS具有較高的特異性(87.5%)和敏感性(80%)，提示CPP在心腎損傷早期有變化，晚期趨于平穩(wěn)，有望為CRS早期診斷提供一種新的較好的生物標(biāo)志物，具有廣闊的應(yīng)用前景。實(shí)際上，新近CPP已被證明在多種臨床疾病預(yù)測的價(jià)值，主要包括心血管疾病，如心臟衰竭、心肌梗死等[4, 10-11]。而腎臟疾病的相關(guān)報(bào)道甚少，僅見Kim等[12]證實(shí)CPP可以作為血液透析患者左心室功能障礙診斷的有用指標(biāo)，ROC分析顯示，AUC為0.737，臨界值為125.48 ng/L，敏感性和特異性分別為0.7和0.8；但也有相反的結(jié)論，認(rèn)為CPP對(duì)慢性腎臟病患者血管外科圍手術(shù)期心血管并發(fā)事件的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測潛力不足[13]，或者新生兒與圍產(chǎn)期窒息動(dòng)物模型中，CPP不能作為診斷急性腎損傷的特異標(biāo)志物[14]。本文進(jìn)一步的相關(guān)分析顯示，血清與尿液中的CPP與BNP和BUN均不具備相關(guān)性，可能與CRS的復(fù)雜病理生理機(jī)制有關(guān)，BNP在臨床上公認(rèn)是心力衰竭臨床診斷性標(biāo)志，盡管有報(bào)道認(rèn)為在CRS的早期診斷中有一定的應(yīng)用價(jià)值[2, 15]，但在CRS患者體內(nèi)是否會(huì)因?yàn)樾乃セ蚰I小球?yàn)V過率下降而在體內(nèi)蓄積引起，以及對(duì)腎功能不全的診斷價(jià)值等方面，有待進(jìn)一步研究[16]。

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