吳茱萸堿抑制Huh7細胞生長并增強細胞對TRAIL的敏感性*

張慶然， 周昭伶， 潘振海， 馬亞鵬， 馬志強， 費洪榮

(泰山醫(yī)學院藥學院， 山東 泰安 271016)

吳茱萸又稱吳萸或曲藥子，為蕓香科吳茱萸[Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.]或疏毛吳茱萸[E.rutaecarpaBenth. var.bodinieri(Dode) Huang]的干燥近成熟果實，具有抗炎、抑菌和抗腫瘤等活性[1]。吳茱萸堿(evodiamine，Evo)是吳茱萸中的主要活性成分，屬于色胺吲哚類生物堿，具有抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖和免疫增強等活性，能夠調(diào)控包括肺癌細胞A549和肝癌細胞HepG2等多種腫瘤細胞的增殖與凋亡[2-4]。本研究以肝癌細胞株Huh7為研究對象，觀察吳茱萸堿對Huh7細胞的活力與凋亡的影響，確定吳茱萸堿協(xié)同促進腫瘤壞死因子凋亡誘導配體(tumors necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的抗腫瘤活性，并初步闡明其內(nèi)在的分子機制，為其臨床應用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1實驗材料

吳茱萸堿購自北京百靈威科技有限公司；胎牛血清購自Gibco；MTT和抗β-actin抗體購自Sigma；DNA片段末端標記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自Roche；ECL化學發(fā)光試劑盒購自Merck Millipore；抗p-細胞分裂周期蛋白2(cell division cycle protein 2, Cdc2)、caspase-3、多聚ADP核糖聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase, PARP]和死亡受體5(death receptor 5，DR5)抗體購自Cell Signaling Technology；抗p27抗體購自BD Biosciences；抗cyclin B1、Cdc2和DR4抗體購自Santa Cruz；II抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；重組人TRAIL蛋白購自R&D Systems。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞Huh7購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，在含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。

2.2MTT法檢測細胞活力 接種Huh7細胞于96 孔板中，24 h后加入不同劑量的吳茱萸堿，對照組加入DMSO；終止培養(yǎng)前4 h加20 μL 5 g/L的 MTT 于各孔中，然后吸去孔中的培養(yǎng)液，再加入150 μL 的DMSO，室溫振蕩10 min；用酶標儀(波長490 nm)測定各孔的吸光度(A)值，以同樣的方法測6個平行孔，計算細胞活力抑制率。

2.3流式細胞術(shù)分析細胞周期分布 Huh7細胞經(jīng)吳茱萸堿(0、0.5、1和5 mg/L)處理24 h后，胰酶消化并制備單細胞懸液，然后用75% 的冷無水乙醇 4 ℃固定過夜。離心除去乙醇后，細胞加入RNase A并于37 ℃孵育30 min；加入碘化丙啶室溫染色15 min；最后用流式細胞儀檢測細胞周期。

2.4TUNEL法檢測細胞凋亡 Huh7細胞經(jīng)吳茱萸堿(0、1和5 mg/L)作用24 h后，PBS洗滌細胞3次，于4 ℃固定細胞1 h，0.2% Triton X-100 打孔2 min。然后按照TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書對細胞進行凋亡染色，倒置熒光顯微鏡觀察細胞的TUNEL染色結(jié)果，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2.5Western blot實驗 Huh7細胞經(jīng)吳茱萸堿作用24 h，用含有蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解液冰上裂解20 min，4 ℃、13 000×g離心 20 min，收集上清定量分析。取30～40 μg總蛋白進行 SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜。加入I抗室溫孵育3 h后，加入II抗室溫孵育1 h；最后用ECL顯色試劑盒曝光顯影。實驗重復3次。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0 軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1吳茱萸堿抑制Huh7細胞活力

肝癌細胞Huh7經(jīng)不同濃度的吳茱萸堿處理24 h后，MTT法檢測細胞活力。結(jié)果表明，與對照組相比，吳茱萸堿可明顯抑制Huh7細胞活力(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Evodiamine (Evo) inhibited the viability of Huh7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖1吳茱萸堿抑制肝癌細胞Huh7活力

2吳茱萸堿誘導Huh7細胞阻滯于G2/M期

用流式細胞術(shù)檢測吳茱萸堿對Huh7細胞周期的影響。從圖2和表1可以看出，與對照組比較，Huh7細胞經(jīng)吳茱萸堿作用24 h后，處于G2/M期的細胞數(shù)量明顯增多，而G1期和S期的細胞數(shù)目則相應減少(P<0.05)，表明吳茱萸堿阻滯Huh7細胞于G2/M期，進而抑制Huh7細胞生長。

Figure 2. The effect of evodiamine on the cell cycle distribution of Huh7 cells.

圖2吳茱萸堿對Huh7細胞周期的影響

表1吳茱萸堿對Huh7細胞周期分布的影響

Table 1. After exposure to evodiamine (Evo) for 24 h, the cell cycle distribution of Huh7 cells was determined by flow cytometry analysis (%. Mean±SD.n=3)

Evo(mg/L)G0/G1G2/MS049．39±1．6611．27±1．2538．81±1．920．515．42±1．70?65．74±2．89?19．59±1．78?110．54±1．48?70．97±2．85?18．49±1．82?510．98±1．77?72．02±2．91?17．01±1．64?

*P<0.05vs0 mg/L group.

為進一步闡明吳茱萸堿誘導細胞周期阻滯的分子機制，本研究采用Western blot實驗檢測細胞周期相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果表明，Huh7細胞經(jīng)吳茱萸堿處理24 h后，與對照組比較，p27、Cdc2、p-Cdc2和cyclin B1的蛋白水平均明顯升高(P<0.05)，見圖3。

3吳茱萸堿誘導Huh7細胞發(fā)生凋亡

TUNEL染色法檢測了吳茱萸堿對 Huh7細胞凋亡的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，經(jīng)吳茱萸堿作用24 h后，凋亡細胞的數(shù)量明顯增加，見圖4。

Figure 3. The effect of evodiamine (Evo) on the expression levels of cell cycle-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖3吳茱萸堿對Huh7細胞周期相關(guān)蛋白表達水平的影響

Figure 4. Evodiamine (Evo) induced the apoptosis of Huh7 cells. The cells were incubated with the indicated concentrations of Evo for 24 h, and induction of apoptosis was determined by TUNEL staining (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖4吳茱萸堿誘導Huh7細胞發(fā)生凋亡

Western blot實驗結(jié)果表明，經(jīng)吳茱萸堿作用24 h后，caspase-3和PARP的切割明顯增多(P<0.05)，提示吳茱萸堿促進Huh7細胞的凋亡可能與促進caspase-3和PARP的切割有關(guān)，見圖5。

Figure 5. Cleavage of caspase-3 and PARP in Huh7 cells treated with evodiamine (Evo) was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖5吳茱萸堿促進Huh7細胞中caspase-3和PARP的剪切

4吳茱萸堿促進TRAIL對Huh7細胞活力的抑制作用

MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與TRAIL(100 μg/L)或吳茱萸堿(1 mg/L)單獨處理組相比，TRAIL和吳茱萸堿共同處理組對Huh7細胞活力的抑制作用顯著提高，見圖6。

同時，Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿與TRAIL聯(lián)用后，Huh7細胞中caspase-3和PARP的切割明顯增加(P<0.05)，見圖7。

5吳茱萸堿上調(diào)Huh7細胞中死亡受體5的表達

為進一步探討吳茱萸堿增加Huh7細胞對TRAIL 敏感性的機制，Western blot檢測了DR4和DR5的表達。與對照組相比，吳茱萸堿明顯提高DR5的蛋白表達(P<0.05)，而DR4的表達水平未見明顯變化，見圖8。

討 論

細胞周期調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生的生物學基礎(chǔ)之一。調(diào)控細胞周期的進程也成為抗腫瘤藥物活性設(shè)計的一個新途徑。細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶是2大主要的細胞周期調(diào)控分子[5]。Cyclin B1是激酶Cdc2的調(diào)節(jié)亞基，與Cdc2形成活性復合物，在S期和G2/M期合成并累積，參與調(diào)控G2/M期轉(zhuǎn)換[6-7]。本研究結(jié)果表明，不同濃度的吳茱萸堿作用于Huh7細胞24 h后，細胞發(fā)生G2/M期阻滯，同時Cdc2、cyclin B1和p27的表達水平升高，表明吳茱萸堿可能通過調(diào)控上述細胞周期相關(guān)蛋白而誘導細胞阻滯于G2/M期。

Huh7細胞經(jīng)吳茱萸堿作用24 h后，Western blot結(jié)果顯示caspase-3和PARP的剪切水平增加。Caspase-3是線粒體介導的細胞凋亡途徑和死亡受體途徑的共同交匯點，是誘導細胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵蛋白酶。當?shù)蛲鲂盘柾ㄟ^各種途徑傳遞到caspase-3后，在各種蛋白水解酶的作用下，caspase-3發(fā)生裂解而活化，進一步切割不同的底物(如PARP等)，最終誘導細胞發(fā)生凋亡[8-9]。

Figure 6. The Huh7 cells were treated with TRAIL at 100 μg/L alone or combined with evodiamine (Evo) at 1 mg/L for 24 h, and then the cell viability was measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEvo+TRAIL group.

圖6吳茱萸堿與TRAIL聯(lián)用對Huh7細胞活力的影響

TRAIL是腫瘤壞死因子超家族成員之一，因其能夠選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡而成為臨床抗腫瘤研究的熱點之一。雖然許多腫瘤細胞對TRAIL表現(xiàn)出耐藥性，但通過深入研究其耐藥機理并與其它藥物聯(lián)合可增加TRAIL 抗腫瘤敏感性，可以極大地提高TRAIL的臨床應用價值[10]。TRAIL對應受體中，死亡受體DR4和DR5參與誘導細胞凋亡[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿能夠通過調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/S6K1信號通路而抑制Mcl-1的表達，進而促進TRAIL對膀胱癌細胞的敏感性[12]；而在膠質(zhì)瘤細胞中，吳茱萸堿協(xié)同促進TRAIL的抗腫瘤活性則與其增加DR4和DR5的表達相關(guān)[13]。

Figure 7. Evodiamine (Evo) enhanced TRAIL-induced cleavage of caspase-3 and PARP in the Huh7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEvo+TRAIL group.

圖7吳茱萸堿與TRAIL聯(lián)用促進caspase-3和PARP的切割

本研究初步表明，吳茱萸堿能夠上調(diào)肝癌細胞Huh7中DR5 的表達，但對DR4的蛋白水平影響不顯著。當吳茱萸堿與TRAIL共同作用Huh7細胞后，細胞活力顯著下降；同時caspase-3和PARP的剪切水平明顯增加，提示吳茱萸堿促進TRAIL的抗腫瘤活性可能與其上調(diào)DR5的表達相關(guān)，但吳茱萸堿上調(diào)DR5表達的分子機制則需進一步深入研究。

Figure 8. Western blot was used to detect the protein expression of DR4 and DR5 in the Huh7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖8Westernblot檢測細胞內(nèi)DR4和DR5的蛋白表達

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