高效液相色譜法測(cè)定黔產(chǎn)五倍子中沒食子酸的含量Δ

鐘 可，吳亞麗，王世清,2#，黃芯琦，劉 珂

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025)

五倍子為常用中藥，始載于《本草拾遺》[1]，來源于漆樹科植物鹽膚木、青麩楊和紅麩楊葉上的蟲癭，主要由五倍子蚜寄生而形成，具有斂肺降火、澀腸止瀉、斂汗、止血和收濕斂瘡的功效[2]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，五倍子具有抗菌、抗氧化和收斂作用[3-5]，臨床上用于防治齲病，治療口瘡、上消化道出血、遺精[6-7]及肛瘺、痔瘡等肛腸疾病[8-9]，其復(fù)方制劑可用于急性濕疹的治療[10]。根據(jù)五倍子的性狀特征，將其分為角倍類、肚倍類和倍花類[11]。我國(guó)五倍子產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的95%以上，以產(chǎn)量高、質(zhì)量好著稱，國(guó)內(nèi)產(chǎn)區(qū)主要集中在貴州省、四川省、湖北省、湖南省、陜西省和云南省[12-13]。五倍子是貴州省著名的道地藥材之一，主要分布于遵義地區(qū)、黔東南、黔南和銅仁等地區(qū)，中部、南部和西部地區(qū)分布較少[14]。五倍子的主要化學(xué)成分為鞣質(zhì)[15]，鞣質(zhì)是葡萄糖上的羥基與沒食子酸所形成的酯類化合物的混合物，在酸性條件下，可水解為沒食子酸，故沒食子酸的含量可反應(yīng)出鞣質(zhì)的含量。本研究采用高效液相色譜法測(cè)定了不同產(chǎn)地、不同性狀特征和不同采收時(shí)間的黔產(chǎn)五倍子藥材中沒食子酸的含量，為五倍子的質(zhì)量研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；Thermo BDS HYPERSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；AL204-lc型萬分之一天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 藥品與試劑

五倍子樣品均野外采集，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院王世清教授鑒定，來源見表1。沒食子酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品鑒定研究所，純度：89.9%，批號(hào)：110831—201204)；甲醇(色譜純，TEDIA天地試劑公司)；甲醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；煙酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Thermo BDS HYPERSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸溶液(V∶V=15∶85)；檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm；柱溫為30 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為39.92 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定過四號(hào)篩(65目)并已烘至恒質(zhì)量的五倍子藥材粉末約0.5 g，精密加入4 mol/L的鹽酸溶液50 ml，水浴加熱水解3.5 h，放冷濾過；精密量取續(xù)濾液1 ml，置于100 ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

精密量取“2.2”“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)≥3 000。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果表明，沒食子酸峰面積的RSD為1.39%，儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱定樣品(編號(hào)：16)粉末6份，每份約0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算沒食子酸含量。結(jié)果表明，沒食子酸含量分別為65.862 2、66.520 5、64.828 1、67.905 7、64.641 8和65.375 2 mg/g，RSD為1.85%，本方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液(編號(hào)：16)適量，于室溫(25 ℃)下放置0、2、4、8、12和24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果表明，沒食子酸峰面積的RSD為1.51%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 五倍子的來源及類別 Tab 1 The originsand categories of Guizhou galla chinensis

2.5.4 線性關(guān)系考察：取沒食子酸對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下方法分別制得質(zhì)量濃度為10.365、31.096、51.827、62.193、75.558和93.289 μg/ml的對(duì)照品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣10 μl，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，得到線性回歸方程為Y=33 048X+38 444(R2=0.999 9)，表明沒食子酸在10.365～93.289 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知含量的樣品(編號(hào)：16)粉末6份，每份約0.25 g，置于錐形瓶中，加入沒食子酸對(duì)照品0.164 7 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算沒食子酸含量。結(jié)果表明，沒食子酸的平均加樣回收率為97.88%，RSD為0.85%，見表2。

A.對(duì)照品； B.供試品 A.reference substance；B.test sample圖1 高效液相色譜圖 Fig 1 HPLC chromatogram

圖2 線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig 2 Standard curve of linear test

樣品量/g樣品含量/g加入量/g測(cè)得量/g加樣回收率/%平均加樣回收率/%RSD/%0.25010.16470.16410.324898.780.25000.16470.16410.318896.960.25020.16470.16410.320897.570.25000.16470.16410.319497.140.24990.16470.16410.325498.970.25020.16470.16410.321797.8497.880.85

2.6 含量測(cè)定

分別精密稱取烘至恒質(zhì)量的各批樣品粉末(過四號(hào)篩，65目)0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備3份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算五倍子藥材中沒食子酸的含量。結(jié)果表明，肚倍(8批)的沒食子酸含量為62.81%～74.79%，平均68.26%；角倍(13批)的沒食子酸含量為52.68%～76.05%，平均69.55%；倍花(23批)的沒食子酸含量為25.71%～53.31%，平均35.07%，見表3。

表3 沒食子酸的含量測(cè)定結(jié)果(n=3) Tab 3 The content determination results of gallic acid in Guizhou galla chinensis(n=3)

3 討論

《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2015年版)規(guī)定，五倍子按干燥品計(jì)算，含鞣質(zhì)以沒食子酸(C7H5O6)計(jì)，不得少于50.00%。本研究結(jié)果表明，黔產(chǎn)肚倍與角倍的沒食子酸含量均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，而倍花中沒食子酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于角倍和肚倍，在23個(gè)樣品中僅有5號(hào)樣品沒食子酸的含量為53.31%，其他均<50%。從沒食子酸含量的角度考慮，倍花不能入藥使用，《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2015年版)五倍子藥材中未收載倍花是有依據(jù)的。但野外采樣過程中發(fā)現(xiàn)大量倍花的存在，市場(chǎng)調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)肚倍和角倍中混有倍花的情況。采收時(shí)間不同的同一產(chǎn)地和性狀的五倍子，其沒食子酸的含量有所不同。如本研究中，貴陽市黔靈公園所采集的的肚倍(編號(hào)：1—4)中沒食子酸含量有明顯的區(qū)別。不同地區(qū)不同采集時(shí)間的五倍子中沒食子酸的含量不同，表明五倍子中沒食子酸含量與其采收時(shí)間有關(guān)。過早采收，則蟲癭尚未長(zhǎng)大，沒食子酸含量偏低，經(jīng)濟(jì)價(jià)值及藥用價(jià)值都無法最大化；過晚采收，五倍子蚜蟲會(huì)破壁而出，影響藥材的性狀，且沒食子酸含量降低。因此，合理的采收時(shí)間對(duì)五倍子的質(zhì)量非常重要。

[1]唐·陳藏器.《本草拾遺》尚志鈞輯釋[M].合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，2002：2.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：67-68.

[3]趙飛燕.五倍子的藥理作用研究[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2016，16(68)：134.

[4]周昕，周邦靖.113種中藥水煎劑對(duì)銅綠假單胞菌的體外抗菌活性研究[J].國(guó)醫(yī)論壇，2017，32(4)：59-61.

[5]韋嬪，譚艾娟，呂世明，等.中藥消除致病性大腸桿菌耐藥性的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(11)：127-129.

[6]劉玉梅，徐靜舒.五倍子抗口腔致病菌活性物質(zhì)篩選及其體外抑菌效果評(píng)價(jià)[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2017，33(4)：437-441.

[7]顏正華.中藥學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1071-1074.

[8]樊香艷.混合痔術(shù)后熏洗護(hù)理的進(jìn)展[J].中醫(yī)外治雜志，2017，26(1)：53-54.

[9]吳爭(zhēng)光.中醫(yī)辨證加薰洗治療肛裂臨床分析[J].中醫(yī)臨床研究，2016，8(34)：89-90.

[10] 張建軍，林清，李偉，等.黃柏黃芩與五倍子配伍外用治療急性濕疹的藥效研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34(10)：690-693.

[11] 李志國(guó)，湯先赤，夏定久.中國(guó)五倍子[M].昆明：云南科技出版社，2008：1-2.

[12] 楊子祥.五倍子高產(chǎn)培育技術(shù)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2011：5.

[13] 李秀萍，李眷遠(yuǎn)，渠桂榮，等.五倍子的研究概況[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2002，30(3)：72-74.

[14] 王健，付小川，徐華，等.貴州五倍子產(chǎn)區(qū)區(qū)劃[J].經(jīng)濟(jì)林研究，1992，10(1)：32-35.

[15] 郭姝彤，劉永仙，艾彩蓮，等.五倍子有效成分提取分離、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī)，2015，36(6)：762-764.