基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的清開靈注射液作用機制研究Δ

吳嘉瑞，藺夢娟，劉鑫馗

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102)

清開靈注射液是由北京中醫(yī)藥大學(原北京中醫(yī)學院)于20世紀70年代末在古代名方“安宮牛黃丸”基礎(chǔ)上研制而成的中藥注射劑，目前有注射液和凍干粉末2個劑型，均由膽酸、豬去氧膽酸、水牛角、黃芩苷、梔子、金銀花、板藍根和珍珠母組成，具有清熱解毒、化痰通絡(luò)和醒神開竅的功效，尤其在腦血管疾病、上呼吸道感染、肝炎和高熱等方面具有良好的臨床療效。目前，清開靈注射液已進入國家基本藥品目錄，是首批全國中醫(yī)院急診科(室)必備中成藥之一。方中膽酸、豬去氧膽酸為牛黃的替代品，牛黃味苦性涼，善清心肝之邪熱，能清心解毒、息風定驚、豁痰開竅而醒神，為君藥；牛黃主要成分為膽酸與去氧膽酸，而豬去氧膽酸為異去氧膽酸，效用與去氧膽酸相似，因此，方中膽酸、豬去氧膽酸共為君藥。水牛角為犀角的代用品，兩者化學成分和藥理作用相似，水牛角苦寒入心肝血分，能清熱涼血、瀉火解毒定驚；黃芩苷代表原方中黃芩，黃芩性味苦寒，功效清熱燥濕、瀉火解毒，能瀉膽、肺之實火，兼除濕熱；金銀花為甘寒之品，清熱解毒、疏散風熱，善清肺、心、胃之熱毒，有透熱達表、透營轉(zhuǎn)氣之功；三者共為臣藥，助君藥清心包熱毒之力。梔子苦寒清降，瀉三焦火邪而導熱下行、瀉心火而除煩，兼清利肝膽濕熱、涼血解毒；板藍根苦寒，入心、胃經(jīng)，善清熱解毒、涼血利咽；兩者佐助君、臣藥加強全方清熱解毒之功。珍珠母咸寒質(zhì)重，入心、肝經(jīng)，既清肝平肝，又鎮(zhèn)驚安神，佐助臣藥水牛角清熱、鎮(zhèn)驚和安神。全方苦寒、甘寒和咸寒并用，共奏清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒神開竅和鎮(zhèn)驚安神之功[1-3]。根據(jù)君臣佐使的組方原則及七情和合的配伍原則，結(jié)合藥物性味和功效，清開靈注射液全方藥物可以劃分為“膽酸-豬去氧膽酸”“水牛角-珍珠母”“黃芩苷-梔子”和“金銀花-板藍根”4個組合(或稱藥對)，藥對內(nèi)部均為相須或相使配伍，各藥對之間又相輔相成，相互配合，形成全方。實驗研究結(jié)果顯示，清開靈注射液具有抗菌、抗病毒、解熱、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗腦缺血、改善學習記憶、保肝及抗心肌缺血等多種藥理作用。也可見以往對清開靈注射液的作用機制研究多采用動物實驗、細胞實驗等方法對其某一作用機制進行研究，難以獲得其作用機制網(wǎng)絡(luò)的整體面貌。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學融合系統(tǒng)生物學、多向藥理學、生物信息學和計算機科學等多學科的技術(shù)、內(nèi)容，進行“疾病表型-基因-靶點-藥物”等多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，指導新藥研發(fā)，闡明藥物作用機制，其整體性、系統(tǒng)性及復雜性的研究視角和研究方法，與中醫(yī)藥的特點不謀而合[4]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，通過構(gòu)建清開靈注射液的“藥物-成分-靶標-疾病”多層次生物網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合基因功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，開展清開靈注射液的作用機制研究。

1 資料與方法

1.1 藥物分子信息的收集和活性分子的篩選

(1)膽酸、黃芩苷：通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，分別獲得兩者的分子信息，包括分子名稱、InChI Key、相對分子質(zhì)量(molecular weight，WM)、類藥性(drug-likeness，DL)、辛醇-水分配系數(shù)(ALogP)、血-腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)、氫鍵配位電子供體數(shù)目(Hdon)、氫鍵配位電子受體數(shù)目(Hacc)、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目(RBN)、分子極性表面積(TPSA)、半衰期(half life，，HL，t1/2)和分子結(jié)構(gòu)。(2)梔子、金銀花和板藍根：①通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別獲得三者的藥物成分及分子信息(同膽酸、黃芩苷)。其中，考慮到含糖基的化合物在體內(nèi)可能通過糖苷酶水解作用被去糖基，TCMSP數(shù)據(jù)庫中也收錄了這些化合物的糖苷配基，并將其命名為“化合物_qt”，因此，所獲得三者的藥物分子中可能也包括這些化合物的糖苷配基[5]。②活性分子的篩選：中藥成分復雜，經(jīng)過制劑工藝和體內(nèi)過程，并非所有成分均能進入體內(nèi)發(fā)揮藥效；考慮中藥注射劑的劑型特點，結(jié)合對藥物體內(nèi)過程[吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)，ADME]相關(guān)性質(zhì)的預測，篩選可能功效物質(zhì)和活性分子。由于研究資源和手段的限制，結(jié)合文獻中已有的研究成果，通過多次預實驗，最后將ALogP<5和DL≥0.18作為ADME性質(zhì)參數(shù)預測清開靈注射液中梔子、金銀花和板藍根所提供的有效成分的條件。其中，ALogP是反映生物膜之間通透性的主要物理化學參數(shù)之一，TCMSP數(shù)據(jù)庫中的ALogP由軟件ALOGPS 2.1計算得出[5]，根據(jù)里賓斯基五規(guī)則設(shè)置該參數(shù)的閾值；DL指化合物與大多數(shù)已知藥物之間在理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征等方面的相似性[5-6]，TCMSP數(shù)據(jù)庫中的DL依據(jù)Tanimoto系數(shù)計算得出，描述了TCMSP數(shù)據(jù)庫中的化合物與DrugBank數(shù)據(jù)庫中所有藥物之間的相似度，根據(jù)所有相似度的平均值DL=0.18設(shè)置該參數(shù)閾值[5]。③結(jié)合相關(guān)文獻[3]，在板藍根中補充腺苷這一成分，通過檢索中藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine integrated database，TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid/search/)并鏈接到PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)獲得相應分子信息，包括分子名稱、InChI Key、WM、辛醇-水分配系數(shù)(XLogP3)、Hdon、Hacc、RBN、TPSA和分子結(jié)構(gòu)。(3)豬去氧膽酸：檢索PubChem Compound數(shù)據(jù)庫，獲得豬去氧膽酸的分子信息(同腺苷)。(4)水牛角、珍珠母：通過檢索TCMID數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻[1，7]，獲得水牛角、珍珠母的藥物成分，通過鏈接PubChem Compound數(shù)據(jù)庫獲得相應分子信息(同腺苷)。

1.2 分子互作靶標和疾病信息的收集

(1)膽酸、黃芩苷、梔子、金銀花和板藍根：檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得各藥味相應分子的作用靶標，其中，梔子、金銀花和板藍根僅獲取所預測活性分子的靶標；根據(jù)所獲靶標，進一步檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得靶標相關(guān)的疾病。另外，板藍根中腺苷對應的靶標和疾病通過TCMID數(shù)據(jù)庫獲得。(2)豬去氧膽酸：利用PubChem BioActivity Analysis Service(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi)獲得豬去氧膽酸分子的作用靶標；然后，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索獲得靶標相關(guān)的疾病。(3)水牛角、珍珠母：通過檢索TCMID數(shù)據(jù)庫獲得相應分子的靶標及靶標相應疾病。

1.3 靶標相應基因的獲取

檢索Uniprot(http://www.uniprot.org/)中的UniprotKB數(shù)據(jù)庫，檢索式為“organism：‘homo sapiens’AND reviewed：yes”。將檢索結(jié)果以Excel格式導出，共20 169條記錄，即獲得UniprotKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中人類的相關(guān)靶蛋白及其對應基因的記錄。采用Excel軟件的“VLOOKUP”函數(shù)匹配“1.2”項下所獲得靶標對應的基因信息。非蛋白質(zhì)的靶標或其他致病菌中的靶標，通過檢索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者利用多種搜索引擎檢索獲得。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與網(wǎng)絡(luò)分析

將清開靈注射液整體處方對應的組方藥物、分子、靶標和相關(guān)疾病導入Cytoscape 3.4.0軟件(http://www.cytoscape.org/)構(gòu)建其“組方藥物-分子-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.4.0軟件的NetworkAnalyzer工具計算網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，包括度值(Degree)、介數(shù)(betweenness centrality，BC)等[2，8-9]，利用Degree和BC排序確定關(guān)鍵節(jié)點，探討清開靈注射液的主要作用靶標、主治疾病及其作用機制。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)分類富集分析

GO是主要為了統(tǒng)一表征所有物種的基因及基因產(chǎn)物的性質(zhì)而發(fā)起的生物信息學計劃[10]。GO數(shù)據(jù)庫(www.geneontology.org)旨在建立一套適用于所用物種的、對基因和蛋白質(zhì)功能進行限定和描述的、并能隨著研究不斷深入而更新的語義詞匯標準。GO有3個分類：(1)細胞組分(cellular component，CC)，指基因產(chǎn)物位于何種細胞器或基因產(chǎn)物組中(如糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核或核糖體和蛋白酶體等)，表明基因產(chǎn)物在什么地方起作用；(2)分子功能(molecular function，MF)，描述基因產(chǎn)物在分子生物學上的活性，如催化活性或結(jié)合活性；(3)生物學過程(biological process，BP)，指由分子功能有序組成的，具有多個步驟的一個過程。GO的結(jié)構(gòu)是個有向無環(huán)圖，每個語義多在自己的類別中與其他語義相關(guān)聯(lián)，有時會與其他類別的語義相關(guān)聯(lián)；語義之間的關(guān)系為“is a”或“part of”。利用Cytoscape 3.4.0軟件Apps中的BiNGO 3.0.3對清開靈注射液整體處方所對應的基因集合進行GO分類富集分析[11-12]。BiNGO Settings面板的參數(shù)設(shè)置如下：簇名分別命名為“DZ-MF”“DZ-BP”和“DZ-CC”；選擇“paste genes from text”，將基因名稱復制粘貼到輸入框中，每個基因單獨占一行；輸出內(nèi)容和方式依次選擇“overrepresentation”“visualization”和“overrepresented categories after correction”，參照集合選擇“use whole annotation as reference set”，物種選擇“Homo Sapiens”，以Cytoscape層次網(wǎng)絡(luò)圖形式輸出該基因集合相較于人類基因組比例更高的GO分類注釋；選擇“Hypergeometric test”的統(tǒng)計方法和“Benjamini & Hochberg False Discovery Rate(FDR)correction”的P校正法，設(shè)置顯著性水平為P<0.01；分別選擇“GO_Molecular_Function”“GO_Cellular_Component”和“GO_Biological_Process”進行GO-MF、GO-CC、GO-BP的富集分析[6]。

1.6 KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/)進行通路富集分析[13]。在DAVID的基因列表通用管理面板中復制粘貼基因列表，選擇基因名稱對應的基因標示符“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，提交基因列表；為所提交的基因列表選擇對應的物種“Homo Sapiens”，背景也選擇“Homo Sapiens”，即以人類全基因組為背景基因和參照集合。選擇分析工具“Functional Annotation Tool”，采用默認的閾值EASE=0.1 and Count=2(EASE Score的閾值指最大P，Count的閾值指與某一通路相關(guān)的基因數(shù)目的最小值，統(tǒng)計檢驗基于modified Fisher Exact法)，可獲得通路富集結(jié)果，點擊鏈接可以查看KEGG(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)數(shù)據(jù)庫中對應的通路圖及其詳情。

1.7 關(guān)鍵模塊的識別與模塊分析

利用Cytoscape 3.4.0軟件Apps中的MCODE 1.4.1對清開靈注射液的“組方藥物-分子-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)進行關(guān)鍵模塊的識別，參數(shù)設(shè)置采用默認值；利用Cytoscape 3.4.0軟件及其Network Analyzer工具查看所識別的模塊，并進行網(wǎng)絡(luò)特征分析，利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對模塊中靶標的對應基因進行GO-BP富集分析和KEGG通路富集分析，探討清開靈注射液中這些模塊的主要作用及其作用機制。

1.8 具有BBB通透性的分子的作用機制分析

在化學成分分子信息分析中，根據(jù)藥物分子的性質(zhì)參數(shù)對其BBB穿透性進行了預測，現(xiàn)將篩選出來的具有一定BBB通透性的藥物分子，結(jié)合清開靈注射液整體處方的“組方藥物-分子-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)，對這些分子節(jié)點進行網(wǎng)絡(luò)特征分析；再利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對這些分子作用靶標的基因進行GO-BP富集分析和KEGG通路富集分析，探討清開靈注射液在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面的作用機制。

2 結(jié)果

2.1 化學成分分子信息分析

清開靈注射液整體處方共篩選出116個藥物成分，其中，77個(占66.4%)分子符合“Lipinski’s rule of five”；24個分子的BBB>-0.3且TPSA<90 ?2，分別為C0006、C0010、C0011、C0012、C0017、C0021、C0024、C0025、C0028、C0030、C0031、C0038、C0041、C0042、C0060、C0061、C0064、C0065、C0069、C0073、C0084、C0090、C0097和C0101，5個分子僅有TPSA且TPSA<90 ?2，分別為C0007、C0018、C0037、C0083和C0112，提示上述29個分子可能具有一定的BBB穿透性，見表1。利用SPSS 20.0軟件對清開靈注射液的116個藥物分子的分子信息進行統(tǒng)計描述，結(jié)果顯示，116個藥物分子的均值符合“Lipinski’s rule of five”，且108個藥物分子有DL且DL≥0.18，說明116個藥物分子總體具有較好的DL。

2.2 “藥物-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析

清開靈注射液的“藥物-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)見圖1，該網(wǎng)絡(luò)圖含有2 324個節(jié)點(8個藥物，116個成分，1 271個靶標，929種疾病)和3 786條邊線，不同節(jié)點分別代表藥物、成分、靶標和疾病，連線表示各節(jié)點之間的相互作用關(guān)系，節(jié)點大小、節(jié)點名稱字號大小與Degree呈正相關(guān)，連線粗細與Edge Betweenness呈正相關(guān)?？梢姡彘_靈注射液中各藥物之間存在各種相互作用關(guān)系，不同藥物可以有相同的化合物分子，同一化合物分子可以作用于不同的靶標，不同的化合物分子也可作用于同一靶標，一個靶標可以與多種疾病相關(guān)，一種疾 病可以涉及多個靶標，形成復雜的網(wǎng)絡(luò)，也充分體現(xiàn)了清開靈注射液作為中藥復方制劑的多成分、多靶標和多途徑的治療機制。對該網(wǎng)絡(luò)的拓撲學性質(zhì)進行分析，采用Degree和BC排序確定關(guān)鍵節(jié)點。清開靈注射液的“藥物-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)中：(1)Degree≥20的化合物分子22個(占20.0%)，其中Degree≥50的靶標有8個，分別為腺苷、膽固醇、精氨酸、天門冬氨酸、槲皮素、芹菜素、山柰酚和木犀草素；(2)degree≥20的靶標有24個(占1.9%)，包括前列腺素內(nèi)環(huán)氧酶2、熱休克蛋白90α、前列腺素內(nèi)環(huán)氧1、凝血酶原、二肽基肽酶4、過氧化物酶體增殖物激活受體γ、雄激素受體、凝血因子X、5-脂氧合酶、β2腎上腺素能受體、碳酸酐酶2、DNA拓撲異構(gòu)酶2α、蛋白激酶A催化亞基C-α、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶催化亞基γ亞型、細胞核受體共激活劑2、胰蛋白酶-1、鈣調(diào)蛋白、雌激素受體、誘導型一氧化氮合酶2、內(nèi)皮型一氧化氮合酶3、腫瘤壞死因子、細胞周期蛋白依賴性激酶2、鈉通道蛋白5型亞基α和絲裂原活化蛋白激酶14；(3)Degree≥5的疾病有24種(占2.6%)，主要涉及惡性腫瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、非小細胞肺癌及實體腫瘤等腫瘤疾病，心血管疾病、動脈粥樣硬化、高血壓病及心肌梗死等循環(huán)系統(tǒng)疾病，阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，非胰島素依賴性糖尿病、肥胖等代謝性疾病，精神分裂癥、焦慮癥等精神障礙和哮喘、炎癥、瘧疾、骨關(guān)節(jié)炎及疼痛等疾病。

表1 清開靈注射液116個藥物分子的分子信息 Tab 1 Statistical results of information of the 116 drug molecules of Qingkailing injection

圖1 清開靈注射液的“藥物-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò) Fig 1 “Drug-composition-target-disease” network of Qingkailing injection

2.3 GO分類富集分析

通過BiNGO獲得了清開靈注射液對應基因集合中1 218個基因的分子功能注釋信息，1 214個基因的細胞組分注釋信息，1 204個基因的生物學過程注釋信息。進一步對以上基因注釋信息進行分類富集分析：(1)GO-MF獲得318條富集結(jié)果(其層次網(wǎng)絡(luò)過于復雜龐大，未在文中表示)，主要涉及跨膜受體活性、受體活性、G-蛋白耦連受體活性、信號轉(zhuǎn)導活性、分子傳感器活性、受體結(jié)合、轉(zhuǎn)運活性、催化活性、蛋白結(jié)合、核苷結(jié)合、腺嘌呤核苷酸結(jié)合、腺嘌呤核糖核苷酸結(jié)合、ATP結(jié)合、嘌呤核苷酸結(jié)合、核苷酸結(jié)合、核糖核苷酸結(jié)合、嘌呤核糖核苷酸結(jié)合和水解酶活性等方面；(2)GO-CC獲得123條富集結(jié)果，其層次網(wǎng)絡(luò)見圖2(節(jié)點大小代表基因數(shù)量多少，顏色深淺代表P大小)，主要涉及細胞膜必需組分、細胞膜固有組分、細胞膜部分、細胞碎片、細胞膜、不溶性碎片、膜碎片、細胞外間隙、細胞外區(qū)域、細胞質(zhì)基質(zhì)、細胞質(zhì)、線粒體、細胞器膜和細胞內(nèi)膜系統(tǒng)等方面；(3)GO-BP獲得1 528條富集結(jié)果(其層次網(wǎng)絡(luò)過于復雜龐大，未在文中表示)，主要涉及化學刺激響應、信號通路、信號傳遞、生物過程正性調(diào)控、刺激響應、多細胞生物過程、代謝過程、初級代謝過程、細胞代謝過程、生物調(diào)控、細胞過程、發(fā)育過程、生物過程調(diào)控、細胞過程調(diào)控、代謝過程調(diào)控和多細胞生物發(fā)育等方面。

2.4 KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對清開靈注射液的基因集合進行KEGG通路富集分析，閾值參數(shù)設(shè)置為EASE=0.01，Count=2，共獲得134條富集結(jié)果，其中EASE<0.01，Count≥10，F(xiàn)DR<0.01的通路，共19條，主要包括6條信號傳導相關(guān)通路、5條代謝通路、5條生物系統(tǒng)相關(guān)通路(涉及消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等)和3條疾病通路(腫瘤疾病和感染性疾病)。具體包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用，環(huán)磷腺苷信號通路，鈣離子信號通路，環(huán)磷鳥苷-蛋白激酶G信號通路，過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路，腫瘤壞死因子信號通路，卵巢類固醇合成，精氨酸生物合成，抗菌藥物生物合成，嘌呤代謝，丙氨酸、天門冬氨酸及谷氨酸代謝，膽汁分泌，脂肪細胞脂解作用調(diào)控，趨化因子信號通路，谷氨酸能突觸，生物鐘周期變化，惡性腫瘤通路，乙型肝炎和胰腺癌。

2.5 模塊識別與模塊分析

盡管網(wǎng)絡(luò)的模塊屬性較低，但可能由于該網(wǎng)絡(luò)比較復雜，利用MCODE進行模塊識別，仍得到6個模塊，見表2，其節(jié)點具體名稱見表3。進一步利用DAVID平臺對6個模塊中的所有靶標的基因進行GO生物學途徑富集分析和KEGG通路富集分析，分析模塊的主要作用機制。閾值參數(shù)設(shè)置為EASE=0.05，Count=2，共獲得62條GO生物學途徑富集結(jié)果和44條KEGG通路富集結(jié)果。其中：(1)EASE<0.05，Count≥10，F(xiàn)DR<0.01的GO生物學過程注釋有8條，依次為心率調(diào)控、平滑肌收縮調(diào)控、游離型鈣離子的釋放介導的心肌收縮的調(diào)控、利阿諾定敏感性鈣釋放通道活性調(diào)控、心肌收縮調(diào)控、胞質(zhì)分裂調(diào)控、G-蛋白耦連受體信號通路和環(huán)核苷酸代謝過程正調(diào)控；(2)EASE<0.05，Count≥10，F(xiàn)DR<0.01的KEGG通路有6條，依次為心肌細胞腎上腺素、環(huán)磷鳥苷-蛋白激酶G信號通路、鈣離子信號通路、環(huán)磷腺苷信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用和瞬時受體電位通道的炎癥介質(zhì)調(diào)控。

2.6 具有BBB通透性的分子的作用機制分析

通過化合物分子性質(zhì)預測，預測出29個分子可能存在一定的BBB通透性，分別來自豬去氧膽酸(1個分子)、水牛角(4個分子)、珍珠母(2個分子)、梔子(4個分子)、金銀花(5個分子)和板藍根(16個分子)，其中某些化合物分子為多個藥物所共有。在清開靈注射液的“藥物-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)(見圖1)中，這29個化合物分子共涉及582個靶標和590種疾病，其中Degree≥20的成分、靶標和Degree≥5疾病見表4。進一步利用DAVID 平臺對29個化合物所有靶標的基因集合進行GO生物學途徑富集分析和KEGG通路富集分析，分析29個化合物的主要作用及作用機制。閾值參數(shù)設(shè)置為EASE=0.01，Count=2，共獲得322條GO生物學途徑富集結(jié)果和60條 KEGG通路富集結(jié)果。其中：(1)EASE<0.01，Count≥2，F(xiàn)DR<0.01的GO生物學過程注釋有76條，前20條結(jié)果依次為膽固醇代謝過程、膽固醇體內(nèi)平衡、脂蛋白代謝過程、膽固醇生物合成過程、脂質(zhì)代謝過程、膽固醇流出、對藥物的響應、離子通道型谷氨酸受體信號通路、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、膽固醇逆轉(zhuǎn)運、高密度脂蛋白粒子重構(gòu)、甘油三酯代謝過程、固醇代謝過程、氧化還原過程、磷脂流出、對營養(yǎng)物的響應、甘油三酯體內(nèi)平衡、對酒精的響應、化學突觸傳遞和類維生素A代謝過程；(2)EASE<0.01，Count≥2，F(xiàn)DR<0.01的KEGG通路有19條，包括2條信號傳導相關(guān)通路、9條代謝通路、3條生物系統(tǒng)相關(guān)通路(涉 及神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng))和5條疾病通路，具體為過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路，神經(jīng)活性配體-受體相互作用，抗菌藥物生物合成，丙氨酸、天門冬氨酸及谷氨酸代謝，類固醇生物合成，精氨酸生物合成，代謝通路，丙酮酸鹽代謝，碳代謝，初級膽汁酸合成，萜類化合物基礎(chǔ)合成，谷氨酸能突觸，脂肪的消化與吸收，膽汁分泌，尼古丁成癮，可卡因成癮，肌萎縮側(cè)索硬化癥，瘧疾和苯丙胺成癮。

圖2 清開靈注射液相應基因GO細胞組分分類的層次網(wǎng)絡(luò) Fig 2 Hierarchical network of GO classified molecular function of Qingkailing injection related genes

排序模塊節(jié)點得分/分1T0776、T0202、T1213、C0101、T0232、C0017、C0024、T0859、T0852、T09343.5562C0092、C0031、T1105、C0034、T0342、T07623.2003T0104、D0480、T0103、D05352.6674T0377、T0785、D0181、C00852.6675D0792、T0221、D0747、T11692.6676C0077、D0175、T0783、T07822.667

表3 6個模塊中所涉及的節(jié)點名稱 Tab 3 Names of nodes involved in the 6 modules

表4 具有BBB通透性的29個化合物及其靶標、疾病和 網(wǎng)絡(luò)參數(shù)(化合物分子、靶標Degree≥20，疾病Degree≥5) Tab 4 29 chemical components with permeability of blood cerebrospinal fluid barrier and their targets, diseases and network parameters(chemical components molecules, targets degree≥20, disease degree≥5)

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學研究策略具有整體性、系統(tǒng)性的特點，這與中醫(yī)藥整體觀與辨證論治的原則不謀而合[14]。目前，已有諸多研究應用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法進行中藥潛在活性成分和作用靶點的預測及中藥作用機制的闡述[15-18]。為了從系統(tǒng)層面研究清開靈注射液的作用機制，本研究構(gòu)建了清開靈注射液整體處方的“藥物-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)，從整體角度體現(xiàn)出了清開靈注射液在疾病治療中多成分、多靶標和多途徑相互配合發(fā)揮綜合治療效果的作用機制，這與清開靈注射液的藥理作用研究進展的綜述結(jié)果一致。進一步通過網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析，發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)同樣具備部分無標度、小世界的網(wǎng)絡(luò)特性，說明網(wǎng)絡(luò)中存在關(guān)鍵節(jié)點。網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點分析結(jié)果表明，清開靈注射液可能通過作用于疾病相關(guān)的多個關(guān)鍵靶標前列腺素內(nèi)環(huán)氧酶2、前列腺素內(nèi)環(huán)氧酶1、熱休克蛋白90α和過氧化物酶體增殖物激活受體γ等，在腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、炎癥及疼痛等疾病中發(fā)揮治療作用。

考慮到清開靈注射液整體處方的節(jié)點較多，網(wǎng)絡(luò)較復雜，且不同藥物涉及的化合物成分、靶標和疾病來自多個數(shù)據(jù)庫，僅利用關(guān)鍵節(jié)點分析對于整個網(wǎng)絡(luò)的認識不夠充分。因此，進一步嘗試運用模塊分析方法探討清開靈注射液整體處方“藥物-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)的復雜機制，對所得6個模塊的基因集合進行GO生物學過程富集分析和KEGG通路富集分析。結(jié)果表明，清開靈注射液參與的多個生物學過程、信號通路與心肌梗死、缺血性心臟病等心血管疾病密切相關(guān)，如心率調(diào)控、心肌收縮調(diào)控、G-蛋白耦連受體信號通路和環(huán)核苷酸代謝過程正調(diào)控等生物學過程，心肌細胞腎上腺素信號通路、環(huán)磷鳥苷-蛋白激酶G信號通路、鈣離子信號通路和環(huán)磷腺苷信號通路等信號通路。但是，結(jié)合文獻報道和臨床實際情況可見，清開靈注射液在臨床上主要用于腦血管疾病的治療，用于心血管疾病的治療較少。一方面，結(jié)合既往對清開靈注射液致不良反應的研究發(fā)現(xiàn)，清開靈注射液確實存在心血管系統(tǒng)方面的不良反應，如心動過速、心動過緩和誘發(fā)洋地黃毒性反應等[19]；另一方面，趙麗紅等[20-22]以急性缺血心肌-再灌注大鼠模型進行的動物實驗研究結(jié)果表明，清開靈注射液對大鼠急性缺血心肌-再灌注損傷具有保護作用。這些均說明心血管系統(tǒng)確實是清開靈注射液的作用部位，但其未被應用于相關(guān)疾病的治療中，值得進一步深入研究。

另外，結(jié)合清開靈注射液醒神開竅的功效及其在腦血管疾病的確切療效，著重對清開靈注射液116個化合物中的29個具有一定BBB通透性的成分進行了亞網(wǎng)絡(luò)分析。網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點分析結(jié)果表明，其主要涉及的疾病為惡性腫瘤和阿爾茨海默病等，但未見急性腦梗死、腦出血等腦血管疾病。結(jié)合4個藥對及清開靈注射液整體處方“藥物-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在關(guān)鍵疾病節(jié)點中均未見急性腦梗死、腦出血等腦血管疾病，這與清開靈注射液的臨床實際應用情況不相符。究其原因，可能與學術(shù)的研究熱點(如阿爾茨海默病是目前學術(shù)界的研究熱點)和數(shù)據(jù)庫的相關(guān)信息收錄存在一定的缺陷(如更新不及時、收錄不全面和收錄學術(shù)研究熱點的概率偏高)等有一定的關(guān)系。值得注意的是，雖然本研究對清開靈注射液的4個藥對及整體處方的“藥物-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點進行分析，未見有腦缺血、中風等典型腦血管疾病作為關(guān)鍵的疾病節(jié)點，但有炎癥、動脈粥樣硬化、高血壓病及血脂異常等相關(guān)病理或疾病作為關(guān)鍵的疾病節(jié)點。

此外，通過對29個具有一定BBB通透性的成分對應基因集合的KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，該亞網(wǎng)絡(luò)與多條成癮性疾病的通路密切相關(guān)，如尼古丁成癮通路、可卡因成癮通路和苯丙胺成癮通路。劉寶錄等[23]曾用地壇牌清開靈注射液靜脈滴注給藥治療121例鴉片或海洛因等毒品成癮的吸毒者，結(jié)果顯示，119例痊愈，2例因依從性較差而治療無效；近期治療效果方面，一般使用清開靈注射液治療7～10 d后，患者軀體依賴基本好轉(zhuǎn)，治療月余后痊愈；長期治療效果方面，使用清開靈注射液治療痊愈后，需配合一段時間的心理治療或給予抗焦慮藥治療2～3個月，可鞏固療效。該臨床報道和本研究結(jié)果佐證了清開靈注射液治療成癮性疾病的可行性，值得進一步研究。

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