星狀病毒鴿群分離株的全基因分析

王楷宬，王素春，莊青葉，邱 源

（中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

星狀病毒是一類無囊膜，呈球形，直徑為28～30 nm的單股正鏈RNA病毒。該病毒最早于腹瀉兒童的糞便中被發(fā)現(xiàn)。其名稱源于病毒粒子在電鏡下呈五角或六角星形[1]。本科病毒包含禽星狀病毒屬和哺乳動(dòng)物星狀病毒屬。其基因組長(zhǎng)度為6.11～7.72 kb[2]。所有星狀病毒的基因組均含3個(gè)開放閱讀框（Open reading frame，ORF），即ORFla、ORFlb和ORF2，基因組兩端為5′和3′非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）。ORFla和ORFlb編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonstructural protein，NSP），ORF2編碼衣殼蛋白（Capsid protein，CP）[3]。迄今為止，對(duì)星狀病毒易感的動(dòng)物多達(dá)22種。在養(yǎng)禽業(yè)中，星狀病毒通常引起幼齡個(gè)體的胃腸道疾病，可導(dǎo)致雞[4]、火雞[5]、珍珠雞[6]、鴨[2]、鴿子[7]和野生水禽[8]的腸炎、腎炎或病毒型肝炎等。

2011年，中國[9]和挪威[10]的研究人員均報(bào)道從鴿子中檢測(cè)到星狀病毒，并發(fā)現(xiàn)該病原屬禽腎炎病毒（Avian nephritis virus，ANV）[7]，并能引起鴿子腹瀉。Tung等[11]于2013年通過高通量測(cè)序在野鴿中檢測(cè)到星狀病毒。此后，未再見有其他關(guān)于鴿子感染星狀病毒的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室于2014年在青島市的肉鴿中檢測(cè)到星狀病毒。為深入了解我國鴿群中的星狀病毒特性，采用高通量測(cè)序方法，對(duì)該毒株進(jìn)行了測(cè)序和基因組分析。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

Ion PGM Template OT2 400 Kit、Ion PGM Sequencing 400 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2%Agarose、Ion 316 Chip Kit V2、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Qubit核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑：購自Life technologies公司。其他設(shè)備包括：超凈工作臺(tái)（美國Forma Scientific）、移液器（Eppendorf）、孵化器（德州誠信孵化設(shè)備有限公司）、高速臺(tái)式離心機(jī)（德國Heraeus Biofuge primoR）、PCR擴(kuò)增儀（Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600）。

高性能計(jì)算平臺(tái)為Dell T630塔式服務(wù)器，具有2顆Intel（R）Xeon（R）CPU E5-2620 v3 @2.40 GHz；內(nèi)存264 G，存儲(chǔ)23 T；操作系統(tǒng)版本為 CentOS Linux release 7.1.1503（Core）。

1.2 核酸提取

2014年秋自山東省青島市某活禽交易市場(chǎng)肉鴿的糞便樣品中檢測(cè)到鴿星狀病毒（Pigeon/China/20/2014）[12]。將該份樣品充分混勻，高速離心和過濾，去除大分子物質(zhì)和細(xì)菌，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德國）提取病毒核酸，-80 ℃保存。

1.3 高通量測(cè)序（NGS）文庫構(gòu)建

對(duì)提取的病毒核酸，采用文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法進(jìn)行NGS文庫構(gòu)建。具體方法為：在8 μL病毒RNA中，加入1 μL 100 μmol/L引物A15N6和2 μL無核酸酶的水進(jìn)行混合，72 ℃ 5 min，然后將RNA引物混合物放在冰上孵育至少3 min；在 混 合 物 中， 加 入 4 μL 5×first-strand buffer、1 μL dNTP（100 μmol/L）、2 μL DTT（0.1 mol/L）、1 μL RNaseOUT ? Recombinant Ribonuclease Inhibitor（40 U/μL） 和 1 μL SuperScript? III Reverse Transcriptase（200 U/μL）（Invitrogen，USA），25 ℃ 反應(yīng)15 min，42 ℃反應(yīng) 30 min，70 ℃ 15 min，終止反應(yīng)；在反應(yīng)產(chǎn)物中，加入1 μL RNase H（TaKaRa，Japan），37 ℃ 反應(yīng) 20 min； 采 用 DynaMag ? -2 Magnet 和 Agencourt?AMPure? XP Reagent（Beckman Coulter，USA）純化合成第一鏈cDNA；在純化的第一鏈cDNA中，加入引物B15N6，70 ℃ 5 min，再加入1 μL Klenow fragment（5 U）（NEB，USA）、5 μL 10×NEBuffer 2、2 μL dNTP（100 μmol/L） 和 1 μL DTT（0.1 mol/L），37 ℃反應(yīng)30 min；最后采用 1×Phusion High-Fidelity Buffer、10 μmol/L 引物A30 和 B30（表1）、0.5 U Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEB，USA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物采用E-Gel? SizeSelect? Agarose Gel進(jìn)行電泳，篩選和回收約450 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其作為NGS文庫。

表1 引物與引物序列

1.4 NGS測(cè)序

將NGS文庫稀釋為26 pmol/L；應(yīng)用Ion PGM Template OT2 400 Kit，對(duì)DNA文庫進(jìn)行測(cè)序前的樣品處理。將處理后的樣品加樣至Ion 316 芯片，置于PGM測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)NGS測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后，采用standalone NCBI BLASTn tool[13]，將測(cè)序得到的reads與GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)（E值為10～5）。由MetaGenome Analyzer（MEGAN）[14]進(jìn)行 BLASTn分析結(jié)果展示；提取其中與星狀病毒序列比對(duì)上的reads，再采用CLC genomics workbench 8.5.1（Qiagen，Germany），將reads進(jìn)行De Novo拼接，并分析拼接完成的基因組中的ORF；將注釋后的序列提交GenBank。

1.6 基因組特性分析

采用MEGA 6.0[15]將Pigeon/China/20/2014的全基因和3個(gè)ORF氨基酸序列，分別與GenBank中星狀病毒科代表毒株（表2）全基因和3個(gè)ORF氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和分析，并分析這些毒株的衣殼蛋白氨基酸序列之間的遺傳距離（p-distance）。

表2 基因比較分析使用的星狀病毒毒株

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組解析

芯片上樣率為79%；測(cè)序文庫得到質(zhì)量較高的序列測(cè)序數(shù)據(jù)。CLC genomics workbench 8.5.1拼接得到的鴿星狀病毒中國分離株全基因大小為6 872 bp，GenBank登錄號(hào)為 MF768270。Pigeon/China/20/2014基因組具有與其他星狀病毒相似的結(jié)構(gòu)和基因順序，其5′端有一段非編碼區(qū)，3′端為聚A尾?；蚪M中主要包含3個(gè)ORF：ORF1a（14～3 028）編碼1 005個(gè)氨基酸的多肽；ORF1b（3 028～4 554）編碼509個(gè)氨基酸RNA依賴的RNA多聚酶；ORF2（4 573～6 594）編碼674個(gè)氨基酸的衣殼蛋白。3′端（6 677～6 711）具有1個(gè)保守的莖環(huán)樣模體（s2m）。有研究推測(cè)，該模體與病毒轉(zhuǎn)錄機(jī)制有關(guān)，在啟動(dòng)蛋白質(zhì)合成過程中起重要作用。在ORF1a和ORF1b 重合區(qū)域存在1個(gè)核糖體移碼序列（RFS）。該序列具有AAAAAAC特征（3 025～3 011）。

2.2 基因組比較分析

Pigeon/China/20/2014與15株禽星狀病毒代表性毒株（表2）衣殼蛋白氨基酸序列的進(jìn)化分析結(jié)果見圖1；各毒株衣殼蛋白氨基酸序列之間的p-distance分析結(jié)果見圖2。衣殼蛋白氨基酸序列進(jìn)化分析結(jié)果顯示，Pigeon/China/20/2014與2003年分離自挪威的野生鴿03/594-9親緣關(guān)系最近（2011年報(bào)道）。按照國際病毒分類委員會(huì)（ICTV）第9次病毒分類報(bào)告中的星狀病毒科分類標(biāo)準(zhǔn)，可將這些禽星狀病毒分為兩個(gè)基因群。所有鴿源星狀病毒均屬于Group Ⅰ。該基因群還包含從雞群分離的禽腎炎病毒（圖3），且不再分基因型。而GroupⅡ包含兩個(gè)基因型（Group ⅡA 和 Group ⅡB），鴨、鵝和火雞的星狀病毒分離株均屬此基因群。

圖1 星狀病毒衣殼蛋白（ORF2）氨基酸序列進(jìn)化分析

圖2 Pigeon/China/20/2014與星狀病毒代表毒株衣殼蛋白氨基酸序列p-distance分析

Pigeon/China/20/2014與2003年分離自挪威的野生鴿03/594-9親緣關(guān)系最近。全基因組進(jìn)化分析結(jié)果見圖3。

其與野生鴿分離的3株星狀病毒（03/594-5、03/594-6和03/594-9）的親緣關(guān)系較近，而與野生鴿分離的這3株星狀病毒同源性更高。ORF1b進(jìn)化分析結(jié)果見圖4。

因從野生鴿中分離的3株星狀病毒和從林鴿中分離的病毒缺少此基因序列，所以Pigeon/China/20/2014與ANV和PeANV親緣關(guān)系較近。ORF1a進(jìn)化分析結(jié)果見圖5。

圖3 星狀病毒全基因進(jìn)化分析

圖4 星狀病毒RNA 依賴的RNA多聚酶（ORF1b）氨基酸序列進(jìn)化分析

圖5 星狀病毒ORF1a氨基酸序列進(jìn)化分析

3 討論

星狀病毒能引起禽的腸炎，并增大幼齡火雞、雞、鵝的死亡率，或者引起雞的腎炎和鴨的致死性肝炎[16]。本文對(duì)從我國華東地區(qū)活禽交易市場(chǎng)售賣的肉鴿中分離的1株星狀病毒基因組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該毒株屬于Group Ⅰ基因群的禽星狀病毒，且與2003年挪威野生鴿分離株（03/594-9）親緣關(guān)系最近，與2011年我國分離的鴿源星狀病毒（SH10）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。挪威分離株（03/594-9）分離自2003年的野生鴿樣品，且發(fā)表的文章僅報(bào)道了該毒株的部分基因組[10]。歷經(jīng)10余年，在我國活禽市場(chǎng)又檢測(cè)到與此相似的病毒。這可能是由于國際貿(mào)易引起的。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的動(dòng)物貿(mào)易檢疫名錄中，未涉及星狀病毒，因此攜帶該病原的鴿子通過國際貿(mào)易引入我國的可能性極大，也不排除通過跨國境賽鴿比賽逐步擴(kuò)散到我國的可能。我國2011年分離的鴿源星狀病毒（SH10）與雞源的禽腎炎病毒親緣關(guān)系較近。而本文報(bào)道的鴿源星狀病毒與2011年分離株不同，說明我國鴿群中感染的星狀病毒較為多樣。我國雖然對(duì)鴨源星狀病毒研究較多，但本文分離的Pigeon/China/20/2014與3株鴨源星狀病毒衣殼蛋白的平均氨基酸遺傳距離（p-distance）在0.735～0.756之間，差異較大。

星狀病毒分為禽星狀病毒屬和哺乳動(dòng)物星狀病毒屬。ICTV第9次病毒分類報(bào)告中星狀病毒科的分類標(biāo)準(zhǔn)為：在氨基酸水平上對(duì)完整的衣殼蛋白進(jìn)行遺傳分析；兩個(gè)基因組之間衣殼蛋白的平均氨基酸遺傳距離（p-distance）在0.204～0.284之間，同一個(gè)基因型氨基酸遺傳距離范圍在0.576～0.741之間。本文對(duì)各種禽類感染的禽星狀病毒屬病毒進(jìn)行了基因分析。按照以上標(biāo)準(zhǔn)，本文分析的禽星狀病毒主要可分為兩個(gè)基因群（Group Ⅰ 和GroupⅡ），Group Ⅱ又分為兩個(gè)基因型（Group ⅡA 和Group ⅡB）。Group Ⅰ基因群中的星狀病毒宿主為雞和鴿；Group Ⅱ基因群中的星狀病毒宿主為鴨、鵝和火雞。衣殼蛋白是星狀病毒的表面蛋白。分析結(jié)果顯示該蛋白可能與宿主嗜型有關(guān)，但其機(jī)制還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本文報(bào)道了我國第2株鴿群星狀病毒全基因，為禽源星狀病毒的進(jìn)一步分類提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有利于了解我國流行的鴿星狀病毒特性。

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