育肥豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒和圓環(huán)病毒混合感染的診斷

牛緒東，馮學(xué)俊，任 禾，馬洪超，張元瑞，葛利江，劉建柱

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安 271018；2.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125）

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科水痘病毒屬的豬皰疹病毒1型偽狂犬病毒（PRV）感染引起的一種急性傳染病。仔豬感染PRV后表現(xiàn)腹瀉和神經(jīng)癥狀，病死率高，育肥豬和成年豬感染后表現(xiàn)呼吸道癥狀，長期排毒，死亡率低[1]。近年來，PRV野毒感染情況較為嚴(yán)重。經(jīng)檢測，群體PRV gE抗體陽性率超過20%[2]。豬瘟（CSF）是由黃病毒科豬瘟病毒屬豬瘟病毒（CSFV）感染引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，具有高傳染性和致死性，是威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一[3]。豬圓環(huán)病毒?。≒CVD）是由圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）感染引起的多個與之相關(guān)疾病的統(tǒng)稱[4]。

2017年8月1日，對山東省臨沂市臨沭縣店頭鎮(zhèn)店頭村某養(yǎng)殖戶的1頭體重約80 kg的病死豬進行了剖檢、問診和PCR檢測，最終確診該死豬為PRV、CSFV和PCV2混合感染。現(xiàn)總結(jié)如下。

1 發(fā)病情況及癥狀

該豬場飼養(yǎng)有經(jīng)產(chǎn)母豬和育肥豬。2017年8月1日前后，僅育肥豬群發(fā)病。病初，病豬精神沉郁，喜臥、扎堆，采食量減少，甚至不食；咳嗽、氣喘，鼻孔處可見白色泡沫狀液體；嘔吐，嘔吐物較黏，呈白色或淡黃色；隨后，可見皮膚發(fā)白，貧血。發(fā)病第3天開始拉稀，糞便呈暗灰色，體溫多在40～41.7 ℃之間。最后，出現(xiàn)眼睛呆滯、倒地和抽風(fēng)等神經(jīng)癥狀，多數(shù)于發(fā)病后第4天開始死亡。死后局部皮膚呈現(xiàn)暗紅色（圖1），鼻孔處有大量淡黃色黏液及白色泡沫狀液體（圖2）。當(dāng)?shù)孬F醫(yī)診治結(jié)果不一。曾肌肉注射多西環(huán)素、氟苯尼考及黃芪多糖等，但發(fā)現(xiàn)均無療效。該豬場曾對母豬免疫注射了CSF細(xì)胞苗、豬PR疫苗、豬細(xì)小病毒疫苗和豬口蹄疫疫苗，但對育肥豬僅注射了CSF細(xì)胞苗。

圖1 皮膚呈現(xiàn)暗紅色區(qū)域

圖2 鼻孔處流出帶有泡沫的黏液

2 剖檢變化

病死豬全身淋巴結(jié)，尤其是頭頸部及肺門淋巴結(jié)出現(xiàn)髓樣腫大、出血、壞死（圖3）；肝臟腫大、出血，并有大量黃白色壞死灶（圖4）；心包積有少量淡黃色液體（圖5），心外膜出血并附有少量纖維素性滲出物，心內(nèi)膜出血（圖6）；脾臟輕度出血、腫大；喉頭和氣管黏膜充血潮紅，氣管及支氣管內(nèi)有大量泡沫狀液體（圖7）；胸腔積有淡黃色液體（圖8），肺臟嚴(yán)重出血、水腫（圖9），并有彌漫性壞死灶（圖10）；扁桃體及咽喉部黏膜嚴(yán)重出血、腫脹、壞死（圖11）；腎臟輕度腫大，表面有多個突起的白色結(jié)節(jié)（圖12）；靠近賁門處的食道黏膜潮紅，且有大量點狀壞死灶（圖13），胃底及幽門處黏膜有多處較深的潰瘍灶（圖14）；大腸黏膜出現(xiàn)“鈕扣狀”潰瘍，回盲口處有大量大小不一的壞死灶（圖15）；硬腦膜無明顯變化，軟腦膜充血、出血、水腫（圖16）。

圖3 淋巴結(jié)髓樣腫大、出血、壞死

圖4 肝臟腫大出血并有黃白色壞死灶

圖5 心包積有淡黃色液體

圖6 心內(nèi)膜出血

圖7 氣管黏膜潮紅，氣管及支氣管內(nèi)有大量泡沫狀液體

圖8 胸腔內(nèi)積有淡黃色液體

圖9 肺臟嚴(yán)重出血和水腫

圖10 肺臟切面可見彌漫性壞死灶

圖11 扁桃體及咽喉部黏膜出血和壞死

圖12 腎臟上可見許多突起的白色結(jié)節(jié)

圖13 食道黏膜潮紅且有大量點狀壞死灶

圖14 胃黏膜有多處潰瘍灶

圖15 大腸黏膜有“鈕扣狀”潰瘍

圖16 軟腦膜充血、出血、水腫

3 實驗室診斷

3.1 材料

RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒和豬H1N1流感的PCR擴增引物：購自上海生工生物公司；CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和PRV的PCR擴增引物：購自北京偉嘉集團山東檢測中心。

3.2 方法

采集病死豬的腦、下頜淋巴結(jié)、肺臟、肝臟和脾臟等組織病料，提取5種病毒基因組。

3.2.1 CSFV和PRRSV 按照RNA提取試劑盒說明書進行RT-PCR檢測。擴增片段大小分別為272 bp和511 bp。產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

3.2.2 PRV 用病死仔豬的腦和下頜淋巴結(jié)提取病毒的DNA進行PCR檢測。目的片段大小為292 bp。采用 25 μL PCR 體系：DNA 樣本1 μL，2×Taq master Mix 12.5 μL，引物 F/R 各 0.5 μL，滅菌 dd H2O 11.5 μL。PCR 程序：95 ℃ 5 min；95 ℃30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，32 個循環(huán)；72 ℃7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

3.2.3 PCV2 按照DNA提取試劑盒說明書進行PCR檢測，對采取的病料進行DNA提取。根據(jù)董亞青等[5]的方法設(shè)計PCV2引物序列。上游引物序列：5′-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3′，下游引物序列：5′-TATGGAAATTCAGGGCATG-3′。目的片段大小515 bp。采用25 μL PCR體系：DNA 樣本 1 μL，2×Taq master Mix12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，滅菌dd H2O 11.5 μL。PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、48 ℃ 25 s、72 ℃ 30 s，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。

3.2.4 豬流感病毒（SIV） 根據(jù)GenBank登錄 的 豬 H1N1流 感（GenBank：AF091308.1）參考株HA基因核苷酸序列進行RT-PCR檢測，設(shè)計用于擴增豬H1N1流感的PCR引物。目的片段大小為563 bp。上游引物序列：5′-TCATCACTTCAGACGCACCAC-3′；下游引物序 列：5′- ACATACTCTTTCGTTCTTCGGTT-3′。PCR 程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。3.3 結(jié)果

CSFV和PRRSV的RT-PCR檢測以及PRV PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在該病料中出現(xiàn)CSFV核酸目的條帶和清晰的PRV目的條帶，而未出現(xiàn)PRRSV核酸目的條帶。PCV2 PCR檢測和SIV RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，該病料中PCV2核酸出現(xiàn)目的條帶（圖17-A），而SIV沒有出現(xiàn)目的條帶（圖17-B）

4 確診結(jié)果

根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀及病理剖檢，初步診斷臨沂該病例為PRV、CSFV、PCV2和SIV的混合感染。通過PCR檢測，發(fā)現(xiàn)PRV和PCV2陽性；通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)CSFV陽性，PRRSV和SIV陰性。最后該病例確診為PRV、CSFV和PCV2的混合感染。

圖17 PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

5 病因分析

該豬場僅按程序給母豬注射了PR疫苗，而對育肥豬沒有進行PR和PCVD免疫接種。這可能是發(fā)生混合感染的主要原因。經(jīng)詢問畜主得知，該豬場飼養(yǎng)了3只可自由出入的家犬。因豬場封閉不嚴(yán)，還經(jīng)常有外來犬只和野貓出入，并且場內(nèi)鼠害成災(zāi)。該病例的PRV感染是否與這些犬只、野貓和老鼠攜帶的PRV有關(guān)[6]，需進一步對犬、貓和鼠攜帶病毒情況進行檢測。對育肥豬，雖然注射了CSF疫苗，但由于沒有進行PR和PCVD免疫，所以豬只比較容易感染PRV和PCV2。這2種病毒均為免疫抑制類病原，對CSF疫苗免疫會產(chǎn)生一定的抑制作用，從而影響了CSF的免疫效果[7]。

6 防控措施

6.1 PR防控

當(dāng)前流行毒株為變異毒株，且致病性較之前更強，抗原性也發(fā)生了一定變異，因此現(xiàn)有疫苗不能對其提供完全的免疫保護[8]。但實踐證明，選用合適的疫苗和免疫程序會取得較好的防治效果。建議選用偽狂犬病A毒株疫苗或HB-98毒株雙基因缺失疫苗[9]。此外需注意，PRV能感染各年齡段豬群。豬群一旦感染可長期帶毒并排毒，而隱性感染豬是PR的主要傳染源，也是造成該病在豬場中難以根除的主要原因[10]。所以種豬場必須定期進行PRV監(jiān)控，一旦發(fā)現(xiàn)有g(shù)E陽性種豬，要堅決淘汰。

6.2 CSF和PCVD防控

對CSF，需采取嚴(yán)格的生物安全措施和合理有效的免疫注射程序。

對PCVD，首先要加強飼養(yǎng)管理，增強豬體免疫力，減少對豬群的各種不良應(yīng)激；其次是做好CSF、PRRS和PR等疾病的防控，避免混合感染；最后要做好PCVD的免疫注射，選擇正確的免疫程序，建議用PCV2滅活疫苗[11]。

6.3 綜合防控

豬場應(yīng)采用封閉式養(yǎng)殖模式，禁止場內(nèi)養(yǎng)犬或限制犬只的活動，要經(jīng)常做好防鼠滅鼠工作；加強豬群的飼養(yǎng)管理，重視豬場的生物安全；做好科學(xué)有效的免疫接種，定期進行疫病檢測。

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[11] 萬遂如. 關(guān)于豬圓環(huán)病毒感染的防控問題[J]. 養(yǎng)豬，2016（3）：93-95.