雞鴨源性成分熒光LAMP檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

徐淑菲，孔繁德，苗 麗，林雙慶

（1. 廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建廈門(mén) 361026；2. 河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南鄭州 450003）

肉和肉制品中的“摻雜使假”是食品質(zhì)量控 制面臨的主要挑戰(zhàn)之一[1]，也是消費(fèi)者投訴的焦點(diǎn)之一。由于價(jià)格差異帶來(lái)的利益誘惑，驅(qū)使一些不法商販或企業(yè)在牛、羊、鹿等高價(jià)肉制品中摻雜一些低價(jià)值的肉原料，如豬肉、雞肉、鴨肉，以及皮毛類(lèi)動(dòng)物肉，如狐貍、水貂、海貍鼠、貉等，甚至還用鼠肉充當(dāng)羊肉，或者將低價(jià)肉經(jīng)過(guò)香精處理后冒充高價(jià)肉[2-3]。這些“摻雜使假”行為不僅侵害了消費(fèi)者權(quán)益，有時(shí)還涉及到民族問(wèn)題或是宗教問(wèn)題，從而造成惡劣的社會(huì)影響。如果問(wèn)題產(chǎn)品出口到國(guó)外，則會(huì)損害我國(guó)食品企業(yè)的整體形象，從而影響出口貿(mào)易[4]。盡管?chē)?guó)外食品生產(chǎn)有較嚴(yán)格的可追溯程序（即每份產(chǎn)品中的所有成分都可以追溯到來(lái)源養(yǎng)殖場(chǎng)，所有中間環(huán)節(jié)產(chǎn)品處理也可以追溯到相關(guān)供應(yīng)商），但也有類(lèi)似的肉類(lèi)摻假報(bào)道，同樣使人擔(dān)憂。為了快速鑒別牛羊肉中是否摻雜了雞肉、鴨肉等其他肉類(lèi)，本文建立了比PCR和qPCR更為快速簡(jiǎn)便的熒光LAMP方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集和處理 試驗(yàn)所用的雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉、犬血液、鴿子、魷魚(yú)、羅非魚(yú)等：廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)項(xiàng)目樣品；山羊肉、綿羊肉：購(gòu)自廈門(mén)市市場(chǎng)；鼠肉：來(lái)自實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物；狐貍?cè)猓汉幽铣鋈刖硻z驗(yàn)檢疫局提供；TaKaRa馬核酸、TaKaRa兔核酸：寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑和儀器 組織DNA提取試劑盒：LabServ公司產(chǎn)品；IMM（Isothermal master mix）試劑：北京晟泰勃科技有限公司產(chǎn)品；2×Taq PCR MasterMix、DL 2000 DNA Marker：TaKaRa公司產(chǎn)品；Veriti 96孔型PCR儀：ABI公司；Genie II等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)：OptiGene公司；Biophotometer plus型核酸蛋白測(cè)定儀：Eppendorf公司。

1.1.3 引物

1.1.3.1 LAMP引物序列 對(duì)不同動(dòng)物的線粒體基因序列進(jìn)行比對(duì)，選取雞、鴨CytB基因作為雞或鴨源性成分的檢測(cè)基因，對(duì)應(yīng)的GenBank號(hào)分別為AY029583.1、EU585609.1（表1）。

1.1.3.2 vLAMP擴(kuò)增片段 紅色粗字體為外引物豬F3序列和豬B3的顛倒互補(bǔ)序列，紅色粗字體之間的基因序列為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增片段（表2）。

1.1.3.3 PCR引物 根據(jù)文獻(xiàn)[5]中的雞鴨特異性引物序列合成引物。雞擴(kuò)增片段大小為256 bp，鴨擴(kuò)增片段大小為292 bp（表3）。

表1 LAMP引物序列

表2 雞、鴨CytB基因LAMP擴(kuò)增片斷

表3 PCR引物序列

1.1.3.4 引物濃度 雞FIP、BIP，鴨FIP、BIP均為20 μmol/L；雞F3、B3、LoopB、loopF，鴨F3、B3、LoopB、loopF均為10 μmol/L。PCR所有引物濃度均為10 μmol/L。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 按照LabServ公司生產(chǎn)的組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取各樣品DNA。經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定，雞肉、鴨肉提取的核酸濃度分別為2.2×102、8.3×102μg/mL。

1.2.2 LAMP方法的建立及優(yōu)化 參考本課題組牛、羊、豬源性成分LAMP方法優(yōu)化的過(guò)程及方案，將雞、鴨源性成分LAMP檢測(cè)的反應(yīng)組分進(jìn)行內(nèi)外引物工作濃度比優(yōu)化、引物工作濃度優(yōu)化、Loop引物加速試驗(yàn)和反應(yīng)溫度優(yōu)化等試驗(yàn)[6-7]。

1.2.3 溶解曲線 根據(jù)優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系和條件進(jìn)行本試驗(yàn)。對(duì)雞（或鴨）源性成分的LAMP檢測(cè)進(jìn)行2個(gè)重復(fù)，設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照。

1.2.4 靈敏度試驗(yàn) 將雞、鴨源性成分核酸分別進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋。稀釋倍數(shù)依次為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

1.2.4.1 LAMP方法 根據(jù)優(yōu)化的最佳反應(yīng)體系和條件進(jìn)行。反應(yīng)管內(nèi)依次加入10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀釋的對(duì)應(yīng)雞（或鴨）源性成分核酸1 μL，補(bǔ)充水至25 μL。

1.2.4.2 PCR方法 反應(yīng)體系包括：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物各1 μL，依次加入10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀釋的雞或鴨源性成分核酸各1 μL，補(bǔ)充水至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系和條件進(jìn)行本試驗(yàn)。第1～15管依次加入雞核酸、鴨核酸、豬核酸、綿羊核酸、鼠核酸、狐核酸、TaKaRa馬核酸、羅非魚(yú)核酸、魷魚(yú)核酸、鴿核酸、犬核酸、山羊核酸、牛核酸、TaKaRa兔核酸各1 μL，補(bǔ)充水至25 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP方法優(yōu)化

雞或鴨源性成分LAMP檢測(cè)方法的內(nèi)外引物最佳工作濃度比（FIP+BIP）∶（F3+B3）均為4∶1（圖1）；引物FIP、BIP、F3、B3的最佳工作濃度分別為1.6、1.6、0.4、0.4 μmol/L（圖2）。對(duì)于雞源性成分LAMP檢測(cè)方法，63～68 ℃均可得到較好的試驗(yàn)結(jié)果；對(duì)于鴨源性成分LAMP檢測(cè)方法，最佳反應(yīng)溫度范圍為62～65 ℃（圖3）。

圖1 內(nèi)外引物工作濃度比的優(yōu)化

圖2 引物FIP、BIP、F3、B3工作濃度優(yōu)化

A. 雞源性成分檢測(cè)LAMP方法；B. 鴨源性成分檢測(cè)LAMP方法；1. 工作濃度分別為0.4、0.4、0.1、0.1 μmol/L；2. 工作濃度分別為0.8、0.8、0.2、0.2 μmol/L；3. 工作濃度分別為1.6、1.6、0.4、0.4 μmol/L；4. 工作濃度分別為3.2、3.2、0.8、0.8 μmol/L；5. 工作濃度分別為6.4、6.4、1.6、1.6 μmol/L；6. 工作濃度分別為12.8、12.8、3.2、3.2 μmol/L；7、8. 空白對(duì)照

圖3 方法反應(yīng)條件優(yōu)化

雞或鴨源性成分LAMP檢測(cè)方法的加速引物試驗(yàn)證明，加速雙引物的加速作用強(qiáng)于加速單引物；兩條加速單引物的加速作用相似；無(wú)加速引物的反應(yīng)所需反應(yīng)時(shí)間最久（圖4）。加速引物的加速作用僅限于加快反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間，并不會(huì)增加假陽(yáng)性概率。加速單引物可以使反應(yīng)時(shí)間縮短一半左右，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該適當(dāng)縮短，可設(shè)置為20 min左右；加速雙引物可以使反應(yīng)時(shí)間縮短2/3左右，反應(yīng)時(shí)間可設(shè)置為15 min左右。

LAMP方法中的溶解曲線是報(bào)告中的退火導(dǎo)數(shù)（Anneal derivative）。雞、鴨LAMP的溶解曲線的峰值分別為87.1、85.2 ℃，均只有1個(gè)峰，且重復(fù)性良好，進(jìn)一步佐證了雞、鴨LAMP方法的可信度（圖5）。

圖4 Loop引物的加速結(jié)果

圖5 溶解曲線

2.2 靈敏度

雞鴨源性成分LAMP檢測(cè)方法：10-1～10-4倍稀釋的核酸孔均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，10-4倍稀釋的核酸孔出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，30 min內(nèi)未出現(xiàn)Ct值，延長(zhǎng)時(shí)間會(huì)出現(xiàn)Ct值。雞源性成分PCR檢測(cè)方法：10-1～10-3倍稀釋的核酸孔均出現(xiàn)清晰的256 bp的目的條帶。兩者LAMP方法的靈敏度比PCR方法高10倍。鴨源性成分LAMP檢測(cè)方法：10-1～10-4倍稀釋的核酸均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，30 min內(nèi)均出現(xiàn)Ct值；鴨源性成分PCR檢測(cè)方法：10-1～10-3倍稀釋的核酸孔均出現(xiàn)清晰的292 bp的目的條帶。鴨源性成分LAMP檢測(cè)方法比PCR方法更靈敏（圖6、表4）。

圖6 靈敏度試驗(yàn)

表4 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 特異性

雞鴨源性成分LAMP檢測(cè)方法只有相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔有典型的擴(kuò)增曲線，其他11種動(dòng)物核酸均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖7）。由此可見(jiàn)，本文建立的雞鴨動(dòng)物源性成分LAMP檢測(cè)方法具有良好的特異性，結(jié)合溶解曲線只有1個(gè)峰值，說(shuō)明該方法具有更高的可信度。

2.4 應(yīng)用

對(duì)市場(chǎng)上50份牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉制品等進(jìn)行了雞鴨源性成分檢測(cè)。在市場(chǎng)中的牛肉、羊肉制品中未發(fā)現(xiàn)雞鴨源性成分；在雞肉制品中檢出雞源性成分，鴨肉制品中檢出鴨源性成分。應(yīng)用結(jié)果說(shuō)明該方法特異性較好，可以用于市場(chǎng)檢測(cè)。而且本文建立的方法和PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致。

圖7 LAMP檢測(cè)方法特異性分析

3 討論

傳統(tǒng)的LAMP方法靈敏度高（比傳統(tǒng)的PCR方法高2～5個(gè)數(shù)量級(jí)），反應(yīng)時(shí)間短（30～60 min就能完成反應(yīng)），臨床使用不需要特殊的儀器，操作簡(jiǎn)單。但傳統(tǒng)的LAMP方法也有缺點(diǎn)：（1）反應(yīng)完畢開(kāi)蓋加熒光染料，易形成氣溶膠污染，加上目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不能?chē)?yán)格分區(qū)，使得假陽(yáng)性問(wèn)題較嚴(yán)重；（2）肉眼觀察判定結(jié)果的主觀性強(qiáng)，對(duì)于弱陽(yáng)性試驗(yàn)，易出現(xiàn)錯(cuò)判；（3）引物設(shè)計(jì)要求高。

為了克服傳統(tǒng)LAMP方法的缺點(diǎn)，本文建立了檢測(cè)雞鴨源性成分的熒光LAMP方法。這是在傳統(tǒng)LAMP方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)完成的。核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與生物熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)對(duì)溫度的精確控制，使核酸在恒溫條件下進(jìn)行快速擴(kuò)增，擴(kuò)增過(guò)程中熒光激發(fā)和檢測(cè)系統(tǒng)完成對(duì)擴(kuò)增過(guò)程的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)控，通過(guò)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線和產(chǎn)物溶解曲線，判定陰陽(yáng)性并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本方法也兼容多種熒光指示劑，如生物熒光，熒光染料，鈣黃綠素和熒光探針等。

相對(duì)于傳統(tǒng)的LAMP方法，本文建立的方法優(yōu)點(diǎn)：（1）反應(yīng)時(shí)間更短（最快僅需15～20 min；10 min左右就可進(jìn)行實(shí)時(shí)初判）；（2）通過(guò)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線和產(chǎn)物溶解曲線判定陰陽(yáng)性并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更可靠；（3）反應(yīng)前加入染料，不需二次開(kāi)蓋，減少了污染。其缺點(diǎn)和傳統(tǒng)的LAMP一樣，對(duì)引物設(shè)計(jì)要求高。

本文在建立了牛、羊、豬源性成分LAMP檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立了雞鴨源性成分LAMP檢測(cè)方法。對(duì)照最佳反應(yīng)體系發(fā)現(xiàn)，最佳內(nèi)外引物工作濃度比（FIP+BIP）∶（F3+B3）均為4∶1，最佳引物FIP、BIP、F3、B3工作濃度均分別為1.6、1.6、0.4、0.4 μmol/L。牛、豬、雞和鴨源性成分的最佳擴(kuò)增反應(yīng)溫度范圍分別為64～66、65～68、63～68、62～65 ℃，默認(rèn)擴(kuò)增反應(yīng)溫度是65 ℃。故這4種動(dòng)物源性成分檢測(cè)的LAMP方法均采用65 ℃作為擴(kuò)增反應(yīng)溫度。羊最佳擴(kuò)增反應(yīng)溫度范圍為66～68 ℃，選擇最接近默認(rèn)擴(kuò)增反應(yīng)溫度的66 ℃作為擴(kuò)增反應(yīng)溫度。

為防止污染，本試驗(yàn)在操作過(guò)程中，將核酸樣本加樣區(qū)和其他試劑加樣區(qū)分別設(shè)在2個(gè)PCR專(zhuān)用超凈工作臺(tái)。除核酸樣本外的其他試劑加入到反應(yīng)管后，蓋好蓋子，然后移至核酸樣本加樣區(qū)，打開(kāi)蓋子并加入對(duì)應(yīng)的核酸樣本后，立即蓋緊蓋子，再操作下一個(gè)核酸樣本，避免交叉污染。核酸樣本加樣順序?yàn)榭瞻讓?duì)照、陰性對(duì)照、各反應(yīng)核酸樣本、陽(yáng)性對(duì)照。

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