基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“膽酸-豬去氧膽酸”作用機制研究Δ

吳嘉瑞，藺夢娟，劉鑫馗

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

清開靈注射液在古方安宮牛黃丸的基礎(chǔ)上研制而成，“膽酸-豬去氧膽酸”為其重要藥物組合。膽酸、豬去氧膽酸為牛黃的替代品，牛黃味苦性涼，善清心肝之邪熱，能清心解毒、息風(fēng)定驚、豁痰開竅而醒神；牛黃的主要成分為膽酸與去氧膽酸，而豬去氧膽酸為異去氧膽酸，效用與去氧膽酸相似，因此膽酸、豬去氧膽酸共為清開靈注射液的君藥[1-2]。以往多采用動物實驗、細胞實驗等方法對中藥的某一作用機制進行研究，難以獲得中藥作用機制網(wǎng)絡(luò)的整體面貌。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、生物信息學(xué)和計算機科學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，進行“疾病表型-基因-靶點-藥物”等多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，指導(dǎo)新藥研發(fā)，闡明藥物作用機制，其整體性、系統(tǒng)性及復(fù)雜性的研究視角和研究方法，與中醫(yī)藥的特點不謀而合[3]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過構(gòu)建“膽酸-豬去氧膽酸”的“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”多層次生物網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合基因功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，開展清開靈注射液的作用機制研究。

1 資料與方法

1.1 藥物分子信息的收集和活性分子的篩選

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)獲得膽酸的分子信息，包括分子名稱、InChI Key、相對分子質(zhì)量(molecular weight，WM)、辛醇-水分配系數(shù)(AlogP)、氫鍵配位電子供體數(shù)目(Hdon)、氫鍵配位電子受體數(shù)目(Hacc)、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目(RBN)、分子極性表面積(TPSA)、類藥性(drug-likeness，DL)、血-腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)、半衰期(half life，HL，t1/2)和分子結(jié)構(gòu)。通過檢索PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)，獲得豬去氧膽酸的主要成分豬去氧膽酸的分子信息，包括分子名稱、InChI Key、WM、辛醇-水分配系數(shù)(XLogP3)、Hdon、Hacc、RBN、TPSA和分子結(jié)構(gòu)。

1.2 分子互作靶標(biāo)和疾病信息的收集

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得膽酸的作用靶標(biāo)，根據(jù)所獲靶標(biāo)，進一步檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得靶標(biāo)相關(guān)的疾病。利用PubChem BioActivity Analysis Service(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi)獲得豬去氧膽酸分子的作用靶標(biāo)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索獲得靶標(biāo)相關(guān)的疾病。

1.3 靶標(biāo)相應(yīng)基因的獲取

檢索Uniprot(http://www.uniprot.org/)中的UniprotKB數(shù)據(jù)庫，檢索式為“organism：‘homo sapiens’ AND reviewed：yes”。將檢索結(jié)果以Excel格式導(dǎo)出，即獲得UniprotKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中人類的相關(guān)靶蛋白及其對應(yīng)基因的記錄。利用Excel軟件的“VLOOKUP”函數(shù)匹配“1.2”項中所獲得靶標(biāo)對應(yīng)的基因信息。非蛋白質(zhì)的靶標(biāo)或其他致病菌中的靶標(biāo)，通過檢索美國國立生物技術(shù)信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者利用多種搜索引擎檢索獲得。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與網(wǎng)絡(luò)分析

將“膽酸-豬去氧膽酸”的藥物、成分、作用靶標(biāo)和相關(guān)疾病導(dǎo)入Cytoscape 3.4.0軟件(http://www.cytoscape.org/)構(gòu)建其“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.4.0軟件的NetworkAnalyzer工具計算網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，包括度值(Degree)，介數(shù)(betweenness centrality，BC)等[4-6]。在生物網(wǎng)絡(luò)中，Degree指1個節(jié)點與其他節(jié)點相連的邊的數(shù)目[7]；BC指網(wǎng)絡(luò)所用的最短路徑中經(jīng)過當(dāng)前節(jié)點的數(shù)目，反映節(jié)點在特定網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)中所處位置的樞紐程度[8]。利用節(jié)點Degree及BC排序確定網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點是目前網(wǎng)絡(luò)分析的主要策略之一[7]。因此，本研究采用該網(wǎng)絡(luò)分析方法，確定關(guān)鍵節(jié)點，探討“膽酸-豬去氧膽酸”的主要作用靶標(biāo)、主治疾病及其作用機制。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)分類富集分析

GO是主要為了統(tǒng)一表征所有物種的基因及基因產(chǎn)物的性質(zhì)而發(fā)起的生物信息學(xué)計劃[9]。GO數(shù)據(jù)庫(www.geneontology.org)旨在建立一套適用于所用物種的、對基因和蛋白質(zhì)功能進行限定和描述的、并能隨著研究不斷深入而更新的語義詞匯標(biāo)準(zhǔn)。GO有3個分類：(1)細胞組分(cell component，CC)，指基因產(chǎn)物位于何種細胞器或基因產(chǎn)物組中(如糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核或核糖體和蛋白酶體等)，表明基因產(chǎn)物在什么地方起作用；(2)分子功能(molecular function，MF)，描述基因產(chǎn)物在分子生物學(xué)上的活性，如催化活性或結(jié)合活性；(3)生物學(xué)過程(biological process，BP)，指由分子功能有序組成的，具有多個步驟的一個過程。GO的結(jié)構(gòu)是個有向無環(huán)圖，每個語義多在自己的類別中與其他語義相關(guān)聯(lián)，有時會與其他類別的語義相關(guān)聯(lián)；語義之間的關(guān)系為“is a”或“part of”。利用Cytoscape 3.4.0軟件Apps中的BiNGO 3.0.3對“膽酸-豬去氧膽酸”對應(yīng)的基因分別進行GO分類富集分析[10-11]。BiNGO Settings面板的參數(shù)設(shè)置如下：簇名分別命名為“DZ-MF”“DZ-BP”和“DZ-CC”；選擇“paste genes from text”，將基因名稱復(fù)制粘貼到輸入框中，每個基因單獨占一行；輸出內(nèi)容和方式依次選擇“overrepresentation”“visualization”和“overrepresented categories after correction”，參照集合選擇“use whole annotation as reference set”，物種選擇“Homo Sapiens”，以Cytoscape層次網(wǎng)絡(luò)圖形式輸出該基因集合相較于人類基因組比例更高的GO分類注釋；選擇“Hypergeometric test”的統(tǒng)計方法和“Benjamini & Hochberg False Discovery Rate(FDR)correction”的P校正法，設(shè)置顯著性水平為P<0.01；分別選擇“GO_Molecular_Function”“GO_Cellular_Component”和“GO_Biological_Process”進行GO-MF、GO-CC和GO-BP的富集分析。

1.6 KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/)進行通路富集分析[12]。在DAVID的基因列表通用管理面板中復(fù)制粘貼基因列表，選擇基因名稱對應(yīng)的基因標(biāo)示符“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，提交基因列表；為所提交的基因列表選擇對應(yīng)的物種“Homo Sapiens”，背景也選擇“Homo Sapiens”，即以人類全基因組為背景基因和參照集合。選擇分析工具“Functional Annotation Tool”，采用默認(rèn)的閾值EASE=0.1 and Count=2(EASE Score的閾值指最大P，Count的閾值指與某一通路相關(guān)的基因數(shù)目的最小值，統(tǒng)計檢驗基于modified Fisher Exact法)，可獲得通路富集結(jié)果，點擊鏈接可以查看KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)中對應(yīng)的通路圖及其詳情。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分分子信息分析

“膽酸-豬去氧膽酸”的2個主要成分膽酸和豬去氧膽酸均符合“Lipinski’s rule of five”[13-14]，且膽酸的DL=0.72>0.18，表明2個成分均具有較好的DL[6，15]；膽酸的BBB=-1.06<-0.3，TPSA=97.99 ?2>90?2，提示其BBB穿透性較差[15-16]；而豬去氧膽酸的TPSA=77.8?2<90?2，提示其可能具有一定的BBB穿透性，見表1。

表1 “膽酸-豬去氧膽酸”的分子信息

注：“—”表示無相關(guān)數(shù)據(jù)

Note：“—”means no relevant data

2.2 “藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析

“膽酸-豬去氧膽酸”的“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)見圖1，共包含18個節(jié)點(2個藥物，2種成分，6個靶標(biāo)，8種疾病)和17條邊線，不同節(jié)點分別代表藥物、成分、靶標(biāo)和疾病，邊線表示各節(jié)點之間的相互作用關(guān)系。通過節(jié)點的Degree和BC排序確定關(guān)鍵節(jié)點，“膽酸-豬去氧膽酸”的“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)節(jié)點及其參數(shù)(Degree≥2)見表2。由圖1、表2可見，“膽酸-豬去氧膽酸”的2個主要成分膽酸和豬去氧膽酸共涉及6個靶標(biāo)，其中，鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)、肝X受體-α氧化型膽固醇受體(oxysterols receptor LXR-alpha，LXRα)和肝X受體-β氧化型膽固醇受體(Oxysterols receptor LXR-beta，LXRβ)等3個靶標(biāo)的Degree和BC較高，每個靶標(biāo)均與多種疾病相關(guān)。前者與腦損傷、妊娠期早發(fā)性高血壓、假性Ⅰ型低醛固酮血癥、高血鉀型腎小管性酸中毒等循環(huán)和泌尿系統(tǒng)疾病有關(guān)；后兩者與動脈粥樣硬化、血脂異常等循環(huán)、代謝性疾病有關(guān)。

圖1 “膽酸-豬去氧膽酸”的“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò) Fig 1 “Drug-composition-target-disease” network of “cholic acid-hyodeoxycholic acid”

節(jié)點名稱DegreeBCT0755MR60.8333C0018豬去氧膽酸40.6190C0005膽酸40.5833T0885LXRα30.3571T0886LXRβ30.3571D0204動脈粥樣硬化20.0952

2.3 GO分類富集分析

通過BiNGO獲得了“膽酸-豬去氧膽酸”的基因集合中5個基因的分子功能、細胞組分注釋信息和4個基因的生物學(xué)過程注釋信息。進一步對以上基因注釋信息進行分類富集分析：GO-MF獲得19條富集結(jié)果，其層次網(wǎng)絡(luò)見圖2，其中“P<0.01且基因數(shù)量百分比≥50.0%”的注釋信息見表3；GO-CC獲得0條富集結(jié)果；GO-BP獲得68條富集結(jié)果，其層次網(wǎng)絡(luò)見圖3，其中前20條“P<0.01且基因數(shù)量百分比≥50.0%”的注釋信息見表4。在圖2—3中，節(jié)點代表基因的功能注釋，節(jié)點面積越大表示其對應(yīng)基因的數(shù)量越多，節(jié)點顏色越深表示其P越小，差異越具有統(tǒng)計學(xué)意義?？梢姡鞣肿庸δ芑蛏飳W(xué)過程注釋之間形成復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，為有向無環(huán)圖，各節(jié)點間既有隸屬關(guān)系，也存在平行關(guān)系。GO分類富集分析的結(jié)果顯示，“膽酸-豬去氧膽酸”的基因集合分別富集在類固醇激素受體活性、配體依賴核受體活性、信號傳導(dǎo)活性、分子傳感器活性及轉(zhuǎn)錄激活活性等分子功能上和胞飲負調(diào)控、三酰甘油生物合成正調(diào)控、膽固醇儲存負調(diào)控、脂蛋白酯酶活性正調(diào)控及膽固醇流出正調(diào)控等生物學(xué)過程中。

圖2 “膽酸-豬去氧膽酸”相應(yīng)基因GO分子功能 分類的層次網(wǎng)絡(luò) Fig 2 Hierarchical network of GO classified molecular function of “cholic acid-hyodeoxycholic acid” related genes

2.4 KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對“膽酸-豬去氧膽酸”的基因集合進行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，“膽酸-豬去氧膽酸”的KEGG通路富集于1個疾病通路和1個信號通路中，分別為胰島素抵抗疾病通路和甲狀腺激素信號通路，見表5。

3 討論

為了從系統(tǒng)層面研究“膽酸-豬去氧膽酸”的作用機制，本研究構(gòu)建了“膽酸-豬去氧膽酸”的“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，分析了藥物成分、靶標(biāo)與疾病之間的相互作用關(guān)系，并對其對應(yīng)基因進行了GO分類功能富集分析和KEGG通路富集分析，為揭示“膽酸-豬去氧膽酸”多成分、多靶點和多途徑的治療機制提供了參考。

通過網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，所獲得的關(guān)鍵靶標(biāo)為MR、LXRα和LXRβ，三者均屬于核受體家族。(1)MR是鹽皮質(zhì)激素如醛固酮和糖皮質(zhì)激素如皮質(zhì)酮、皮質(zhì)醇的作用靶標(biāo)。鹽皮質(zhì)激素具有促進腎小管重吸收鈉而保水、排鉀的主要生理作用；醛固酮是作用最強的天然鹽皮質(zhì)激素，其分泌過高可能引起組織水腫、高血壓、低血鉀等[17]。推測清開靈注射液中的膽酸可能通過作用于MR，影響機體水、電解質(zhì)代謝，從而在腦損傷、妊娠期早發(fā)性高血壓、假性Ⅰ型低醛固酮血癥、高血鉀型腎小管性酸中毒等循環(huán)和泌尿系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用。(2)LXR有LXRα和LXRβ2種亞型，兩者的表達具有組織特異性，LXRα在肝臟表達最高，LXRβ在腦部表達最高，兩者均在膽固醇的吸收、排出及轉(zhuǎn)化和脂肪酸的合成等多方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[18]。LXR具有在肝臟調(diào)控膽固醇的分解、在肝外組織促進膽固醇的酯化儲存與向肝臟的逆轉(zhuǎn)運、抑制小腸過度吸收膽固醇等生理功能。在機體內(nèi)，巨噬細胞或平滑肌細胞若吞噬了過量的膽固醇，則容易變?yōu)榕菽毎菽毎Ｒ娪诟吣懝檀佳Y患者及動脈粥樣硬化患者的粥樣斑塊內(nèi)。而且，高膽固醇血癥也會增加血漿和動脈組織中氧化型膽固醇的含量，而氧化型膽固醇對內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及單核/巨噬細胞均有細胞毒性，且可以抑制膽固醇向肝臟的逆轉(zhuǎn)運，促進泡沫細胞和動脈粥樣斑塊的形成。LXR促進膽固醇的逆轉(zhuǎn)運等生理功能在減少和防止血脂異常和動脈粥樣硬化等疾病形成和發(fā)展中具有重要意義[18-19]。已有藥品豬去氧膽酸片用于Ⅰa和Ⅰb型高脂血癥和動脈粥樣硬化的治療，推測豬去氧膽酸可能通過作用于LXR受體，調(diào)節(jié)機體膽固醇的代謝、儲存及轉(zhuǎn)運等多個環(huán)節(jié)而對血脂異常和動脈粥樣硬化等代謝、循環(huán)系統(tǒng)疾病發(fā)揮治療作用。此外，結(jié)合藥物分子性質(zhì)預(yù)測，表明豬去氧膽酸具有一定的BBB穿透性，而LXRβ在腦部表達最高，對調(diào)節(jié)腦部膽固醇的含量和穩(wěn)定等具有重要意義。腦是富含膽固醇的器官，膽固醇對維持腦神經(jīng)元細胞的生理功能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要作用[18]。推測豬去氧膽酸可能通過作用于LXRβ受體對腦部疾病發(fā)揮治療作用。

表3 “膽酸-豬去氧膽酸”相應(yīng)基因GO分子功能富集分析結(jié)果(P<0.01且基因數(shù)量比≥50.0%)

圖3 “膽酸-豬去氧膽酸”相應(yīng)基因GO生物學(xué)過程分類的層次網(wǎng)絡(luò) Fig 3 Hierarchical network of GO classified biological processes of “cholic acid-hyodeoxycholic acid” related genes

GO-IDGO生物學(xué)過程注釋PP(校正后)基因48550胞飲負調(diào)控5.86×10-89.38×10-6NR1H2|NR1H348548胞飲調(diào)控3.52×10-72.81×10-5NR1H2|NR1H310867三酰甘油生物合成正調(diào)控5.86×10-72.81×10-5NR1H2|NR1H310866三酰甘油生物合成調(diào)控8.79×10-72.81×10-5NR1H2|NR1H310887膽固醇儲存負調(diào)控8.79×10-72.81×10-5NR1H2|NR1H351006脂蛋白酯酶活性正調(diào)控1.64×10-63.38×10-5NR1H2|NR1H310875膽固醇流出正調(diào)控1.64×10-63.38×10-5NR1H2|NR1H332373固醇轉(zhuǎn)運正調(diào)控2.11×10-63.38×10-5NR1H2|NR1H332376膽固醇轉(zhuǎn)運正調(diào)控2.11×10-63.38×10-5NR1H2|NR1H310874膽固醇流出調(diào)控2.11×10-63.38×10-5NR1H2|NR1H390208三酰甘油代謝正調(diào)控3.22×10-64.30×10-5NR1H2|NR1H345723脂肪酸生物合成正調(diào)控3.22×10-64.30×10-5NR1H2|NR1H310885膽固醇儲存調(diào)控3.87×10-64.76×10-5NR1H2|NR1H390207三酰甘油代謝調(diào)控4.57×10-64.87×10-5NR1H2|NR1H310745巨噬細胞源性泡沫細胞分化負調(diào)控4.57×10-64.87×10-5NR1H2|NR1H310888脂質(zhì)儲存負調(diào)控5.33×10-65.33×10-5NR1H2|NR1H332369脂質(zhì)轉(zhuǎn)運負調(diào)控6.15×10-65.79×10-5NR1H2|NR1H345806內(nèi)噬負調(diào)控7.96×10-67.08×10-5NR1H2|NR1H342304脂肪酸生物合成調(diào)控1.00×10-58.01×10-5NR1H2|NR1H332370脂質(zhì)轉(zhuǎn)運正調(diào)控1.00×10-58.01×10-5NR1H2|NR1H3

表5 “膽酸-豬去氧膽酸”相應(yīng)基因KEGG通路富集 分析(EASE<0.1，Count≥2) Tab 5 KEGG pathway enrichment analysis of “cholic acid-hyodeoxycholic acid” related genes(EASE<0.1, Count≥2)

注：FDR為錯誤發(fā)現(xiàn)率；基因數(shù)量比均為40%

Note：FDR means false discovery rate；percentage of genes≥40%

通過對“膽酸-豬去氧膽酸”的基因集合及其功能注釋進行GO分類功能富集分析和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)：(1)基因功能主要體現(xiàn)在胞飲調(diào)控、三酰甘油生物合成調(diào)控、膽固醇儲存調(diào)控、脂蛋白酯酶活性調(diào)控及膽固醇外排調(diào)控等生物學(xué)過程和受體活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、分子傳感器活性及轉(zhuǎn)錄激活活性等分子功能方面，這與LXRα和LXRβ作為轉(zhuǎn)錄因子，與配體結(jié)合激活后，作用于下游基因，上調(diào)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達，調(diào)節(jié)機體膽固醇的代謝的認(rèn)識相一致[18]；(2)KEGG通路主要包括胰島素抵抗信號通路和甲狀腺激素信號通路。胰島素抵抗是指各種原因使胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降，機體代償性地分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定，而胰島素抵抗易導(dǎo)致代謝綜合征和2型糖尿病[20]。清開靈注射液能降低2型糖尿病并發(fā)虹膜睫狀體炎患者血總膽固醇、三酰甘油和纖維蛋白原水平，推測這種調(diào)節(jié)功能可能與“膽酸-豬去氧膽酸”作用于胰島素抵抗信號通路中的NR1H2和NR1H3基因及LXR受體有關(guān)[21]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對“膽酸-豬去氧膽酸”的多成分、多靶點與多種疾病間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系進行研究。研究結(jié)果初步驗證了“膽酸-豬去氧膽酸”的基本藥理學(xué)作用和相關(guān)機制，并為進一步深入探討其作用機制奠定了良好的基礎(chǔ)。

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