基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“黃芩苷-梔子”作用機(jī)制研究Δ

吳嘉瑞，藺夢娟，劉鑫馗

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

清開靈注射液是在古方“安宮牛黃丸”的基礎(chǔ)上研制而成的中藥注射劑，具有清熱解毒、化痰通絡(luò)和醒神開竅之功效，尤其在腦血管疾病、上呼吸道感染、肝炎和高熱等方面具有良好的臨床療效，其已進(jìn)入國家基本藥品目錄，是首批全國中醫(yī)院急診科(室)必備中成藥之一?！包S芩苷-梔子”為清開靈注射液中的重要藥物組合。黃芩、梔子均為清熱藥中的代表藥，黃芩性味苦寒，功效清熱燥濕、瀉火解毒，能瀉膽、肺之實(shí)火，兼除濕熱，其主要有效成分為黃芩苷。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，黃芩具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗過敏和抗氧化等生物活性，其應(yīng)用前景極其廣闊[1]。黃芩苷為黃芩根中的黃酮類化合物，具有抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)、解痙和抗腫瘤等多種生理活性[2]，清開靈注射液中黃芩苷代表其原方安宮牛黃丸中的黃芩。梔子苦寒清降，瀉三焦火邪而導(dǎo)熱下行、瀉心火而除煩，兼清利肝膽濕熱、涼血解毒[3-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，梔子具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、保肝、利膽、降血脂、抗血栓、神經(jīng)保護(hù)和抗阿爾茨海默病等作用[5]。以往多采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等方法對中藥某一作用機(jī)制進(jìn)行研究，難以獲得中藥作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)的整體面貌。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，進(jìn)行“疾病表型-基因-靶點(diǎn)-藥物”等多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，指導(dǎo)新藥研發(fā)，闡明藥物作用機(jī)理，其整體性、系統(tǒng)性及復(fù)雜性的研究視角和研究方法，與中醫(yī)藥的特點(diǎn)不謀而合[6]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過構(gòu)建“黃芩苷-梔子”的“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”多層次生物網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合基因功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，開展“黃芩苷-梔子”的作用機(jī)制研究。

1 資料與方法

1.1 藥物分子信息的收集和活性分子的篩選

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)獲得黃芩苷和梔子的分子信息，包括分子名稱、InChI Key、相對分子質(zhì)量(molecular weight，WM)、辛醇-水分配系數(shù)(ALogP)、氫鍵配位電子供體數(shù)目(Hdon)、氫鍵配位電子受體數(shù)目(Hacc)、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目(RBN)、分子極性表面積(TPSA)、類藥性(drug-likeness，DL)、血-腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)、半衰期(half life，HL，t1/2)和分子結(jié)構(gòu)。其中，考慮到含糖基的化合物在體內(nèi)可能通過糖苷酶水解作用被去糖基，TCMSP數(shù)據(jù)庫中也收錄了這些化合物的糖苷配基，并將其命名為“化合物_qt”，因此，所獲得梔子的藥物分子中可能也包括這些化合物的糖苷配基[7]。中藥成分復(fù)雜，經(jīng)過制劑工藝和體內(nèi)過程，并非所有成分均能進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮藥效；考慮中藥注射劑的劑型特點(diǎn)，結(jié)合對藥物體內(nèi)過程(ADME)相關(guān)性質(zhì)的預(yù)測，篩選可能功效物質(zhì)和活性分子。在TCMSP平臺(tái)中，設(shè)置參數(shù)ALogP<5和DL≥0.18作為梔子中活性成分的篩選條件。

1.2 分子互作靶標(biāo)和疾病信息的收集以及靶標(biāo)相應(yīng)基因的獲取

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得黃芩苷的作用靶標(biāo)、梔子所預(yù)測活性分子的靶標(biāo)，根據(jù)所獲靶標(biāo)，進(jìn)一步檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得靶標(biāo)相關(guān)的疾病。靶標(biāo)相應(yīng)基因通過Uniprot(http：//www.uniprot.org/)獲取，檢索Uniprot中的UniprotKB數(shù)據(jù)庫，檢索式為“organism：‘homo sapiens’ AND reviewed：yes”。將檢索結(jié)果以Excel格式導(dǎo)出，即獲得UniprotKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中人類的相關(guān)靶蛋白及其對應(yīng)基因的記錄。利用Excel軟件的“VLOOKUP”函數(shù)匹配所獲得靶標(biāo)對應(yīng)的基因信息。非蛋白質(zhì)的靶標(biāo)或其他致病菌中的靶標(biāo)，通過檢索NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者利用多種搜索引擎檢索獲得。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與網(wǎng)絡(luò)分析

將“黃芩苷-梔子”的藥物、成分、作用靶標(biāo)和相關(guān)疾病導(dǎo)入Cytoscape 3.4.0軟件(http：//www.cytoscape.org/)構(gòu)建其“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.4.0軟件的Network Analyzer工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括度值(Degree)、介數(shù)(betweenness centrality，BC)等[7-9]。在生物網(wǎng)絡(luò)中，Degree指一個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)相連的邊的數(shù)目[10]；BC指網(wǎng)絡(luò)所用的最短路徑中經(jīng)過當(dāng)前節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，反映節(jié)點(diǎn)在特定網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中所處位置的樞紐程度[11]。利用節(jié)點(diǎn)Degree及BC排序確定網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)是目前網(wǎng)絡(luò)分析的主要策略之一[10]。因此，本研究采用該網(wǎng)絡(luò)分析方法，確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，探討“黃芩苷-梔子”的主要作用靶標(biāo)、主治疾病及其作用機(jī)制。

1.4 基因本體(gene ontology，GO)分類富集分析

GO是主要為了統(tǒng)一表征所有物種的基因及基因產(chǎn)物的性質(zhì)而發(fā)起的生物信息學(xué)計(jì)劃[12]。GO數(shù)據(jù)庫(www.geneontology.org)旨在建立一套適用于所用物種的、對基因和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行限定和描述的、并能隨著研究不斷深入而更新的語義詞匯標(biāo)準(zhǔn)。GO有3個(gè)分類：(1)細(xì)胞組分(cell component，CC)，指基因產(chǎn)物位于何種細(xì)胞器或基因產(chǎn)物組中(如糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核或核糖體和蛋白酶體等)，表明基因產(chǎn)物在什么地方起作用；(2)分子功能(molecular function，MF)，描述基因產(chǎn)物在分子生物學(xué)上的活性，如催化活性或結(jié)合活性；(3)生物學(xué)過程(biological process，BP)，指由分子功能有序組成的，具有多個(gè)步驟的一個(gè)過程。GO的結(jié)構(gòu)是個(gè)有向無環(huán)圖，每個(gè)語義多在自己的類別中與其他語義相關(guān)聯(lián)，有時(shí)會(huì)與其他類別的語義相關(guān)聯(lián)；語義之間的關(guān)系為“is a”或“part of”。利用Cytoscape 3.4.0軟件Apps中的BiNGO 3.0.3對“黃芩苷-梔子”對應(yīng)的基因分別進(jìn)行GO分類富集分析[13-14]。BiNGO Settings面板的參數(shù)設(shè)置如下：簇名分別命名為“DZ-MF”“DZ-BP”和“DZ-CC”；選擇“paste genes from text”，將基因名稱復(fù)制粘貼到輸入框中，每個(gè)基因單獨(dú)占一行；輸出內(nèi)容和方式依次選擇“overrepresentation”“visualization”和“overrepresented categories after correction”，參照集合選擇“use whole annotation as reference set”，物種選擇“Homo Sapiens”，以Cytoscape層次網(wǎng)絡(luò)圖形式輸出該基因集合相較于人類基因組比例更高的GO分類注釋；選擇“Hypergeometric test”的統(tǒng)計(jì)方法和“Benjamini & Hochberg False Discovery Rate(FDR)correction”的P校正法，設(shè)置顯著性水平為P<0.01；分別選擇“GO_Molecular_Function”“GO_Cellular_Component”和“GO_Biological_Process”進(jìn)行GO-MF、GO-CC和GO-BP的富集分析。

1.5 KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，https：//david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行通路富集分析[15]。在DAVID的基因列表通用管理面板中復(fù)制粘貼基因列表，選擇基因名稱對應(yīng)的基因標(biāo)示符“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，提交基因列表；為所提交的基因列表選擇對應(yīng)的物種“Homo Sapiens”，背景也選擇“Homo Sapiens”，即以人類全基因組為背景基因和參照集合。選擇分析工具“Functional Annotation Tool”，采用默認(rèn)的閾值EASE=0.1 and Count=2(EASE Score的閾值指最大P，Count的閾值指與某一通路相關(guān)的基因數(shù)目的最小值，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)基于modified Fisher Exact法)，可獲得通路富集結(jié)果，點(diǎn)擊鏈接可以查看KEGG數(shù)據(jù)庫(http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html)中對應(yīng)的通路圖及其詳情。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分分子信息分析

“黃芩苷-梔子”共篩選出20個(gè)藥物分子，主要包括環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類和綠原酸類化合物。其中，10個(gè)(50.0%)分子符合“Lipinski’s rule of five”；5個(gè)分子的BBB>-0.3且TPSA<90?2，分別為異前胡醚(C0041)、番紅花酸(C0077)、傘房花耳草素(C0024)、歐前胡素(C0073)和白楊素(C0090)，提示這5個(gè)分子可能具有一定的BBB穿透性。利用SPSS 20軟件統(tǒng)計(jì)“黃芩苷-梔子”20個(gè)藥物分子的分子信息的最小值、最大值、均值和標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果顯示，20個(gè)藥物分子的均值符合“Lipinski’s rule of five”，且DL≥0.18，說明20個(gè)藥物分子總體具有較好的DL，見表1。

表1 “黃芩苷-梔子”20個(gè)藥物分子的分子信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果 Tab 1 Statistical results of information of the 20 drug molecules of “baicalin-gardenia”

2.2 “藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析

“黃芩苷-梔子”的“藥物-分子-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)見圖1，該網(wǎng)絡(luò)圖含有589個(gè)節(jié)點(diǎn)(2個(gè)藥物，20種成分，198個(gè)靶標(biāo)，369種疾病)和927條連線，節(jié)點(diǎn)大小、節(jié)點(diǎn)名稱字號大小與Degree呈正相關(guān)，連線粗細(xì)與Edge Betweenness呈正相關(guān)。其節(jié)點(diǎn)Degree分布和最短路徑長度分布見圖2；采用Degree和BC排序確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中Degree≥10的成分、靶標(biāo)和Degree≥5疾病節(jié)點(diǎn)見表2。由圖1、表2可見，在“黃芩苷-梔子”網(wǎng)絡(luò)中：(1)Degree≥10的化合物分子為槲皮素、山柰酚、蘆丁、白楊素、傘房花耳草素、番紅花酸、3-甲基山柰酚、丁香脂素，其中，槲皮素和山柰酚的Degree分別為151和62，遠(yuǎn)高于其他化合物節(jié)點(diǎn)。(2)Degree≥10的靶標(biāo)分別為前列腺素內(nèi)環(huán)氧酶2(prostaglandin G/H synthase 2，COX-2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)、5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase，5-LOX)、凝血酶原、肝藥酶CYP1A2、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、熱休克蛋白90α、β2腎上腺素能受體、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P(glutathione S-transferase P，GSTP1-1)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶3、絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK-14)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、雄激素受體、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2α、72 kDa的Ⅳ型膠原酶(72 kDa type Ⅳ collagenase，MMP-2)、凝血因子X、二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP-4)、雌激素受體、間質(zhì)膠原酶(interstitial collagenase，MMP-1)、毒蕈堿型乙酰膽堿受體M2、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸-3-激酶催化亞基γ亞型(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma isoform，PI3K-γ)、碳酸酐酶2(carbonic anhydrase 2，CA-Ⅱ)。其中，COX-2、PPARγ和5-LOX的Degree分別為41、30和29，相對較高。(3)Degree≥5的疾病包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌及肺癌等腫瘤和非胰島素依賴性糖尿病、心血管疾病、阿爾茨海默癥、骨關(guān)節(jié)炎及哮喘等。結(jié)合已有的研究證據(jù)，黃芩苷和梔子苷為清開靈注射液的主要成分[6]，應(yīng)進(jìn)行重點(diǎn)分析。在圖1中，黃芩苷(C0045)和梔子苷(C0040)共涉及10個(gè)靶標(biāo)和18種疾病，主要靶標(biāo)包括凝血因子X、CA-Ⅱ、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶(mRNA of protein-tyrosine phosphatase, non-receptor type 1，PTP-1B)、血紅素氧化酶-1(heme oxygenase 1，HO-1)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶1(glutathioneS-transferaseMu 1，GSTM1-1)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2(gGlutathioneS-transferaseMu 2，GSTM2-2)，主要疾病包括心血管疾病、胰腺癌、非胰島素依賴性糖尿病、肥胖、血栓性疾病和凝血障礙等，見表3。

圖1 “黃芩苷-梔子”的“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò) Fig 1 “Drug-composition-target-disease” network of “baicalin-gardenia”

2.3 GO分類富集分析

通過BiNGO獲得了“黃芩苷-梔子”的基因集合中194個(gè)基因的分子功能注釋信息，195個(gè)基因的細(xì)胞組分注釋信息，192個(gè)基因的生物學(xué)過程注釋信息。進(jìn)一步對以上基因注釋信息進(jìn)行分類富集分析：(1)GO-MF獲得143條富集結(jié)果，其層次網(wǎng)絡(luò)見圖3(節(jié)點(diǎn)大小代表基因數(shù)量多少，顏色深淺代表P大小)，主要涉及蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、受體結(jié)合、受體結(jié)合、蛋白二聚化活性、序列特異性DNA結(jié)合、激酶活性、氧化還原酶活性、分子傳感器活性、信號傳導(dǎo)活性和轉(zhuǎn)錄因子活性等方面；(2)GO-CC獲得62條富集結(jié)果，其層次網(wǎng)絡(luò)見圖4(節(jié)點(diǎn)大小代表基因數(shù)量多少，顏色深淺代表P大小)，主要涉及細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞碎片、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞膜、蛋白復(fù)合物、大分子復(fù)合物和細(xì)胞器內(nèi)腔等方面；(3)GO-BP獲得1 209條富集結(jié)果，其層次網(wǎng)絡(luò)過于復(fù)雜龐大，未在文中表示，僅列出其中P<0.01且基因數(shù)量百分比≥10.0%的前20條注釋信息，主要涉及化學(xué)刺激響應(yīng)、壓力響應(yīng)、內(nèi)源性刺激響應(yīng)、生物過程正/負(fù)調(diào)控、細(xì)胞過程正調(diào)控、細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞凋亡調(diào)控、細(xì)胞程序性死亡調(diào)控和發(fā)育過程調(diào)控等方面，見表4。

2.4 KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對“黃芩苷-梔子”的基因集合進(jìn)行KEGG通路富集分析，閾值參數(shù)設(shè)置為EASE=0.05，Count=5，共獲得130條富集結(jié)果，列出EASE<0.05，Count≥10，F(xiàn)DR<0.01的前20條通路，包括TNF信號通路、HIF-1信號通路等2條信號通路和18條疾病通路，見表5。18條疾病通路中，涉及10條惡性腫瘤通路，分別為惡性腫瘤通路、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、慢性粒細(xì)胞白血病、結(jié)直腸癌和惡性腫瘤蛋白多糖；涉及8條感染性疾病通路，分別為乙型肝炎、美洲錐蟲病、利什曼病、百日咳、弓形蟲病、人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型感染、肺結(jié)核和甲型流行性感冒。

a.節(jié)點(diǎn)Degree分布；b.最短路徑長度分布 a.distribution of values of node degrees；b.distribution of lengths of the shortest paths圖2 “黃芩苷-梔子”的“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)性質(zhì)分析 Fig 2 Properties analysis of “drug-composition-target-disease” network of “baicalin-gardenia”

節(jié)點(diǎn)名稱DegreeBCC0086槲皮素1510.6239C0048山柰酚620.1695C0024傘房花耳草素270.0793C0044蘆丁220.0438C0090白楊素200.0464C0077番紅花酸150.0443C01003-甲基山柰酚120.0203C0056丁香脂素100.0057C0040梔子苷90.0117C0073歐前胡素90.0032T0998前列腺素G/H合成酶2410.1042T0922PPARγ300.0598T01545-LOX290.0749T1024凝血酶原180.0389T0356肝藥酶CYP1A2180.0380T1218TNF180.0371T0582熱休克蛋白90α180.0354T0202β2腎上腺素能受體170.0387T0430EGFR170.0350T0545GSTP1-1160.0391T0851內(nèi)皮型一氧化氮合酶3160.0387T0762MAPK-14150.0187T0655IL-6140.0354T0120雄激素受體140.0338T0342細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2140.0310T0391DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2α140.0295T0036MMP-2140.0151T0310凝血因子X130.0222T0385DPP-4130.0196T0441雌激素受體130.0192T0657MMP-1120.0171T0783毒蕈堿型乙酰膽堿受體M2110.0206T0934PI3K-γ100.0148T0239CA-Ⅱ100.0050D0247非特異性惡性腫瘤170.0240D0175阿爾茨海默病100.0130D0231乳腺癌90.0089D0259心血管疾病,未指定70.0077D0747胰腺癌70.0062D0792前列腺癌70.0019D0574炎癥60.0059D0203哮喘60.0053D0715非小細(xì)胞肺癌60.0044D0181鎮(zhèn)痛藥50.0043D0714非胰島素依賴型糖尿病50.0026D0735骨關(guān)節(jié)炎50.0025D0629肺癌50.0010

表3 黃芩苷和梔子苷及其靶標(biāo)、疾病的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)(靶標(biāo)和疾病Degree≥3) Tab 3 Network parameters of baicalin, geniposide and their targets and diseases(degree of targets and diseases ≥3)

3 討論

為了從系統(tǒng)層面研究“黃芩苷-梔子”的作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了“黃芩苷-梔子”的“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，從整體角度體現(xiàn)出了“黃芩苷-梔子”多成分、多靶標(biāo)和多途徑的治療機(jī)制。進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)同樣具備部分無標(biāo)度和小世界的網(wǎng)絡(luò)特性，說明網(wǎng)絡(luò)中存在關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。以節(jié)點(diǎn)Degree和BC排序，結(jié)果顯示，化合物分子槲皮素、山柰酚，靶標(biāo)COX-2、PPARγ和5-LOX，疾病乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌及肺癌等腫瘤疾病和非胰島素依賴性糖尿病、心血管疾病、阿爾茨海默癥、骨關(guān)節(jié)炎及哮喘等可能為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。另外，結(jié)合已有研究成果，黃芩苷和梔子苷為清開靈注射液主要成分，將兩者納入重點(diǎn)分析。

通過“黃芩苷-梔子”的“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)可見，槲皮素、山柰酚、黃芩苷和梔子苷均對多個(gè)靶標(biāo)具有調(diào)控作用。其中，槲皮素和山柰酚均作用于關(guān)鍵靶標(biāo)COX-2、PPARγ和5-LOX，推測兩者可能在相關(guān)疾病的治療中存在協(xié)同作用。槲 皮素和山柰酚均為黃酮類化合物，均具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病原微生物、心血管系統(tǒng)保護(hù)、降糖和降脂等多種藥理活性[16-17]。山柰酚可抑制大鼠肝癌細(xì)胞CBRH 7919，人胃癌MGC-803細(xì)胞、人食管鱗癌Eca-109細(xì)胞及小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞等的增值并誘導(dǎo)其凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[18-21]；槲皮素也可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的生長及增殖和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐多藥等途徑發(fā)揮預(yù)防惡性腫瘤、抗惡性腫瘤作用[18]。COX-2為誘導(dǎo)性酶，在促癌劑、炎性因子等刺激下，通 過表達(dá)上調(diào)，參與炎癥和腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[22]； PPARγ是由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核激素受體超家族成員，其生物學(xué)功能復(fù)雜，包括調(diào)控脂肪和糖代謝、能量平衡，抑制炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，抑制腫瘤血管生成，抗動(dòng)脈粥樣硬化，降脂降壓，改善心功能并參與心室重構(gòu)等，與腫瘤疾病、心血管疾病和糖尿病等疾病密切相關(guān)[23-24]；5-LOX是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為白三烯和氫氧化物5-羥基花生四烯酸的關(guān)鍵酶，主要與過敏性疾病、炎癥、腫瘤和腦缺血損傷等疾病相關(guān)，研究結(jié)果表明，5-LOX抑制劑能抑制多種惡性腫瘤的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。說明槲皮素和山柰酚可能通過作用于關(guān)鍵靶標(biāo)COX-2、PPARγ和5-LOX，在腫瘤、炎癥和心血管系統(tǒng)疾病等疾病中發(fā)揮治療作用。由此可見，“黃芩苷-梔子”體現(xiàn)出了清開靈注射液的部分藥理活性。

圖3 “黃芩苷-梔子”相應(yīng)基因GO分子功能分類的層次網(wǎng)絡(luò) Fig 3 Hierarchical network of GO classified molecular function of “baicalin-gardenia” related genes

圖4 “黃芩苷-梔子”相應(yīng)基因GO細(xì)胞組分分類的層次網(wǎng)絡(luò) Fig 4 Hierarchical network of GO classified cellular compositions of “baicalin-gardenia” related genes

GO-IDGO生物學(xué)過程注釋P校正后P基因數(shù)量(n/N)基因42221化學(xué)刺激響應(yīng)4.49×10-591.39×10-55110/192SERPINE1|PLAT|AHR|MPO|TNF等6950壓力響應(yīng)1.88×10-472.90×10-44107/192NCF1|SERPINE1|PLAT|AHR|MPO等48518生物過程正調(diào)控1.87×10-461.9×10-43116/192RB1|CHRM3|CHRM1|SERPINE1|AHR等10033有機(jī)物響應(yīng)1.11×10-438.59×10-4177/192CDKN1A|SERPINE1|PTEN|HSPB1|PLAT等50896刺激響應(yīng)3.55×10-402.19×10-37136/192CHRM2|NCF1|SERPINE1|PLAT|AHR等42127細(xì)胞增殖調(diào)控2.99×10-381.54×10-3571/192RB1|CDKN1A|CHRM1|CXCL8|SERPINE1等48522細(xì)胞過程正調(diào)控4.65×10-372.05×10-34101/192RB1|CHRM1|SERPINE1|AHR|ELK1等48519生物過程負(fù)調(diào)控6.88×10-362.66×10-33100/192RB1|SERPINE1|PLAT|ELK1|MPO等51239多細(xì)胞生物過程調(diào)控2.20×10-357.54×10-3375/192RB1|CHRM2|ACHE|CHRM3|SERPINE1等42981細(xì)胞凋亡調(diào)控3.71×10-341.15×10-3167/192TOP2A|GSK3B|CDKN1A|SERPINE1|PTEN等43067細(xì)胞程序性死亡調(diào)控6.62×10-341.86×10-3167/192TOP2A|GSK3B|CDKN1A|SERPINE1|PTEN等10941細(xì)胞死亡調(diào)控1.09×10-332.81×10-3167/192TOP2A|GSK3B|CDKN1A|SERPINE1|PTEN等48523細(xì)胞過程負(fù)調(diào)控2.10×10-334.99×10-3193/192RB1|ACHE|GSK3B|CDKN1A|CXCL8等9719內(nèi)源性刺激響應(yīng)2.31×10-335.10×10-3153/192CDKN1A|SERPINE1|PTEN|PLAT|ADRA1B等32879定位調(diào)控1.70×10-313.50×10-2960/192ACHE|GSK3B|SERPINE1|PTEN|TNF等43066細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控2.50×10-314.82×10-2946/192GSK3B|CDKN1A|GSTP1|SERPINE1|PTEN等43069細(xì)胞程序性死亡負(fù)調(diào)控4.53×10-318.23×10-2946/192GSK3B|CDKN1A|GSTP1|SERPINE1|PTEN等60548細(xì)胞死亡負(fù)調(diào)控1.15×10-301.98×10-2846/192GSK3B|CDKN1A|GSTP1|SERPINE1|PTEN等48583刺激響應(yīng)調(diào)控6.57×10-301.07×10-2751/192CXCL8|SERPINE1|TNF|ICAM1|THBD等50793發(fā)育過程調(diào)控1.79×10-292.76×10-2760/192RB1|SERPINE1|ITGB2|PTEN|TNF等

注：FDR為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率

Note：FDR means false discovery rate

GO富集分析結(jié)果表明，“黃芩苷-梔子”主要在化學(xué)刺激響應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞程序性死亡調(diào)控等生物學(xué)途徑中發(fā)揮作用。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，“黃芩苷-梔子”作用的大部分基因富集在與惡性腫瘤有直接關(guān)系的通路上，包括惡性腫瘤通路、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、慢性粒細(xì)胞白血病、結(jié)直腸癌和惡性腫瘤蛋白多糖等；另有大部分基因富集在與感染性疾病相關(guān)的通路，包括乙型肝炎、美洲錐蟲病、利什曼病、百日咳、弓形蟲病、人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型感染、肺結(jié)核和甲型流感等。由此推斷，“黃芩苷-梔子”發(fā)揮抗菌、抗炎和抗腫瘤等藥理活性可能與其作用于多種惡性腫瘤、炎癥等相關(guān)信號通路密切相關(guān)。本研究為“黃芩苷-梔子”發(fā)揮多種藥理活性的潛在作用機(jī)制提供了一定的參考。

[1]吉曉麗.黃芩的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)臨床研究，2017，9(9)：128-129.

[2]楊萍.清開靈注射液中黃芩苷和梔子苷的藥代動(dòng)力學(xué)研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[3]葉任高，傅玉素.實(shí)用方劑速記便覽[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：229-232.

[4]謝鳴.方劑學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2016：213-214.

[5]王亭.中藥梔子有效成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J].中國藥師，2015，18(10)：1782-1784.

[6]羅國安，王義明，梁瓊麟，等.中醫(yī)藥系統(tǒng)生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2011：2-8，426-427.

[7]姚瑤.基于系統(tǒng)藥理學(xué)的中藥復(fù)方配伍及作用機(jī)制研究[D].咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[8]劉惠.基于系統(tǒng)藥理學(xué)的甘草作用機(jī)制和新藥發(fā)現(xiàn)研究[D].咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[9]張新莊，蕭偉，徐筱杰，等.利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究熱毒寧注射液抗流感病毒的分子作用機(jī)制[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29(7)：1415-1420.

[10] 馮春來，顧於梅，秦悅，等.基于模塊分解的生物網(wǎng)絡(luò)分析算法及其應(yīng)用[J].中成藥，2016，38(10)：2227-2232.

[11] 黃海濱，楊路明，王建新，等.基于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涞纳锞W(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)識別研究進(jìn)展[J].數(shù)學(xué)的實(shí)踐與認(rèn)識，2011，41(7)：114-125.

[12] The Gene Ontology Consortium.The Gene Ontology project in 2008[J].Nucleic Acids Res，2008，36(Database issue)：D440-D444.

[13] 楊蓉，蔡琳.BiNGO及DAVID在miR-155靶基因富集分析中的應(yīng)用[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，46(6)：408-414.

[14] Maere S，Heymans K，Kuiper M.BiNGO：a Cytoscape plugin to assess overrepresentation of gene ontology categories in biological networks[J].Bioinformatics，2005，21(16)：3448-3449.

[15] Huang da W，Sherman BT，Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J].Nat Protoc，2009，4(1)：44-57.

[16] 駱明旭，羅丹，趙萬紅.槲皮素藥理作用研究進(jìn)展[J].中國民族民間醫(yī)藥，2014(17)：12-14.

[17] 孔令希.山柰酚抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)理探討及其藥代動(dòng)力學(xué)研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2014.

[18] 周瑤，杜標(biāo)炎，譚宇蕙，等.山柰酚對大鼠肝癌細(xì)胞CBRH 7919的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27(3)：250-253.

[19] 杜標(biāo)炎，周瑤，譚宇蕙，等.山柰酚對人胃癌MGC-803細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用[J].腫瘤，2010，30(6)：477-480.

[20] 李瑞君，梅家轉(zhuǎn)，劉桂舉.山奈酚誘導(dǎo)人食管鱗癌Eca-109細(xì)胞凋亡及其機(jī)制[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31(8)：1440-1442.

[21] 廖崢嶸，沈永青，趙娟，等.山奈酚對人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞凋亡的影響[J].河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，35(5)：510-514.

[22] 劉智豪，劉叔文，余樂.COX-2抑制劑聯(lián)合抗腫瘤的研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(12)：1651-1654.

[23] 劉貴波，劉躍光，孫成，等.山奈酚對2型糖尿病大鼠糖脂代謝及胰島素抵抗的影響[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2012，16(9)：1-3.

[24] 馬晶晶，章濤.PPARγ功能與疾病關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(5)：601-604.

[25] 許輝.5-脂氧合酶在腫瘤中的作用和機(jī)制[J].長沙醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，7(15)：36-41.