水動(dòng)力輔助吸取成人脂肪來源干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)和鑒定研究

陳 陽, 宋良萍，察鵬飛，彭 錚，何 宇

（1.福州市皮膚病防治院整形美容外科 福建 福州 350025；2.福建國際旅行衛(wèi)生保健中心 福建 福州 350001）

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是機(jī)體中一小部分具有擴(kuò)增和多向分化能力的非造血基質(zhì)細(xì)胞，屬于成體干細(xì)胞的一種，可以通過誘導(dǎo)向特定的細(xì)胞系進(jìn)行分化，并最終達(dá)到構(gòu)建特定組織的目的，由于其體外高增殖率及多向分化潛能，已成為組織工程研究中種子細(xì)胞的重要來源[1-2]。雖然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)早已成功獲取，并曾成為干細(xì)胞的主要來源，但是抽取骨髓不僅會(huì)給供體造成痛苦，而且來源有限，且存在倫理問題，所以其廣泛應(yīng)用受到限制[3-4]。近年來學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中也含有大量具有自我更新能力和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，類似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，也稱為脂肪來源干細(xì)胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)，其來源充足，且體外培養(yǎng)擴(kuò)增速度快，不必進(jìn)行永生化就能獲得足夠的細(xì)胞，可充分滿足臨床治療需要，被認(rèn)為是一種理想的組織工程種子細(xì)胞來源，并已越來越多被應(yīng)用于構(gòu)建組織工程研究[5-7]。而水動(dòng)力輔助吸脂具有取材簡(jiǎn)便、損傷小，抽吸后殘留于供區(qū)的脂肪組織仍可擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于美容外科吸脂手術(shù)[8]。然而，如何分離成人ADSCs并進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)以及多系定向誘導(dǎo)分化已成為目前迫切需要解決的問題。為此，參考相關(guān)學(xué)者的研究方法，并進(jìn)行綜合和改進(jìn)，以探索ADSCs的體外分離、培養(yǎng)與鑒定的便捷方法，以期為其能夠作為組織工程理想的種子細(xì)胞及廣泛應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 脂肪組織取材：選擇成人脂肪豐厚的部位，如腹、腰、臀、股等部位（圖1）。皮下浸潤注射局部腫脹麻醉液麻醉（腫脹液：林格氏液1 000ml+2%鹽酸利多卡因15ml+腎上腺素1mg+5%碳酸氫鈉溶液12.5ml），于吸脂部位隱蔽處，采用11號(hào)刀片作3～5mm皮膚切口，選用直徑3.8mm抽吸灌注探針，負(fù)壓設(shè)置-0.5～-0.6bar，水流噴射強(qiáng)度2～3級(jí)，由深層向淺層呈扇形反復(fù)抽吸獲取脂肪顆粒組織（圖2）。

圖1 腹部脂肪抽吸示意圖

1.2 脂肪顆粒組織的純化：在4℃～10℃條件下，于注射器內(nèi)用林格氏液反復(fù)清洗吸取的脂肪顆粒組織，去除混雜的血液、腫脹液、破碎脂肪細(xì)胞和纖維組織，獲得純化脂肪顆粒組織。

圖2 水動(dòng)力吸脂獲取脂肪組織

1.3 試劑及耗材：高糖DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素原液、I型膠原酶、PBS、胰蛋白酶、地塞米松、IBMX（Gibco BRL公司），胎牛血清購自PAA公司，胰島素購自Cenview公司，油紅“O”購自Amresco公司，抗CD44單克隆抗體及細(xì)胞免疫組織化學(xué)SP Kit檢測(cè)試劑盒購自zymed公司，15ml、50ml尖底離心管、25cm2培養(yǎng)皿、一次性3ml吸管、55cm2培養(yǎng)瓶（美國Corning公司），超凈工作臺(tái)(蘇州凈化總廠) ，CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，脂肪來源干細(xì)胞成骨、成軟骨、成脂、成肌分化誘導(dǎo)液（賽業(yè)廣州生物科技有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 ADSCs的分離與原代培養(yǎng)：取抽吸的脂肪顆粒組織約20ml，浸于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于取材后2h內(nèi)在超凈工作臺(tái)中用PBS洗滌，進(jìn)一步去除脂肪組織中肉眼可見的纖維及血管成分，剪切約20min，加入1%膠原酶(體積約為脂肪組織的2倍)，在37℃下消化40min，并不斷震蕩或攪拌，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。200目濾網(wǎng)過濾，1 300r/min離心5min，棄去上層漂浮的脂肪細(xì)胞和培養(yǎng)液，沉積的細(xì)胞用少量DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，吹打均勻，接種于1～2瓶50ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入適量含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素原液的高糖DMEM培養(yǎng)基，混合均勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。24h后首次換液，去除懸浮細(xì)胞。隨后每2～3d換液，約1周后細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)：以0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA進(jìn)行消化，于室溫下消化lmin，在倒置顯微鏡下觀察見胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，立即吸出消化液，加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化，用吸管將細(xì)胞吹打下來，800r/min離心5min。用含10%胎牛血清，1%青、鏈霉素原液的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸沉積細(xì)胞，按1傳2的比例進(jìn)行傳代。當(dāng)傳代細(xì)胞生長(zhǎng)接近單層匯合70%時(shí)，可繼續(xù)傳代。

1.4.3 繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：將細(xì)胞懸液混勻，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl。從第2天起每日隨機(jī)取3孔，胰蛋白酶消化細(xì)胞，分別用血球計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，取其均數(shù)，以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，吸光度值（A570nm）為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。并根據(jù)Patterson公式Td=T×lg2／lg(Nt／N0)計(jì)算出細(xì)胞群體倍增時(shí)間。

1.4.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)：取第2代細(xì)胞爬片用于免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。室溫下，0.01mol/L PBS液洗去培養(yǎng)基，丙酮固定10min，PBS液漂洗3次，每次5min。加入3%H2O2,于37℃作用10min，PBS沖洗。加入3%TritonX-100，37℃下作用30min，PBS沖洗。血清封閉液37℃封閉15min，按1:200用PBS稀釋的CD44-抗?jié)窈兄?℃過夜。次晨0.01mol/L PBS液沖洗，滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃作用60min，PBS沖洗。加入HRP標(biāo)記生物素抗體，37℃作用60min，PBS沖洗，DAB顯色，沖洗，脫水，明膠甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4.5 多系定向誘導(dǎo)分化：取傳代培養(yǎng)的3代細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，分別用成脂細(xì)胞培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清，1%青、鏈霉素原液，10μmol/L地塞米松，10μmol/L胰島素，20μmol/L消炎痛)、成骨細(xì)胞培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清，1%青、鏈霉素原液，0.1μmol/L地塞米松，50μmol/L抗壞血酸磷酸鈉，10μmol/L β2磷酸甘油）、成軟骨培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清，1%青、鏈霉素原液，6.25mg/L胰島素, 10μg/L TGF-β，50μmol/L抗壞血酸磷酸鈉）、成肌肉培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清，1%青、鏈霉素原液，50μmol/L氫化可的松）重懸細(xì)胞，接種于55cm2培養(yǎng)皿中，于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化2周后在相差顯微鏡下觀察，對(duì)成脂誘導(dǎo)組進(jìn)行油紅“O”脂肪顆粒染色，對(duì)成骨誘導(dǎo)組進(jìn)行堿性磷酸酶組化染色，對(duì)成軟骨誘導(dǎo)組進(jìn)行Ⅱ型膠原染色，對(duì)成肌誘導(dǎo)組進(jìn)行肌漿球蛋白組化染色。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：接種后細(xì)胞在24h內(nèi)貼壁，初為小圓形，細(xì)胞大小不等，核/漿比例較大，細(xì)胞核幾乎充滿胞漿。2～4d后可見細(xì)胞伸展，大多數(shù)細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，核橢圓形，較大，期間也可見形態(tài)、體積不一的多種細(xì)胞成分（圖3）。此后細(xì)胞增殖旺盛，原代培養(yǎng)的細(xì)胞7～10d后即達(dá)70%～80%融合并可進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞形態(tài)無大變化，2～4d左右可達(dá)到單層匯合約80%，可再次進(jìn)行傳代。體外培養(yǎng)10代以后，細(xì)胞的增殖速度無明顯減慢。2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，第2天左右進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，第6天左右到達(dá)高峰，細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為60h（圖4）。

圖3 傳代培養(yǎng)后細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

圖4 傳代培養(yǎng)第3代ADSCs生長(zhǎng)曲線

2.3 細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定結(jié)果：約70%的培養(yǎng)細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量黃褐色顆粒，顯示對(duì)CD44抗原呈陽性反應(yīng)（圖5）。

2.4 多系定向誘導(dǎo)分化結(jié)果：加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2～4d后，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)含有脂滴的脂肪細(xì)胞，1周后達(dá)到高峰，同時(shí)細(xì)胞中小脂滴逐漸融合，形成大的脂滴，并開始向外界分泌，此時(shí)油紅“O”染色后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒，證明鏡下所見細(xì)胞內(nèi)顆粒確為脂滴（圖6）。相同方法證實(shí)成骨誘導(dǎo)堿性磷酸酶組化染色呈陽性(圖7)，成軟骨誘導(dǎo)Ⅱ型膠原染色呈陽性（圖8），成肌誘導(dǎo)肌漿球蛋白組化染色呈陽性（圖9）。

3 討論

2001年，Zuk等以外科切除或吸脂方式獲取的人或大鼠脂肪組織為研究對(duì)象，按照Katz等[9]的干細(xì)胞分離方法，將脂肪組織切碎，經(jīng)I型膠原酶消化、離心等簡(jiǎn)單處理獲得在顯微鏡下呈成纖維細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞群，稱其為加工過的脂肪抽吸物細(xì)胞，體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞群具有穩(wěn)定的倍增效應(yīng)和低衰老性，且能夠向多種細(xì)胞類型分化，與干細(xì)胞所特有的多向分化潛能及自我復(fù)制能力等基本特征一致。由于該細(xì)胞群可從脂肪組織抽吸物中大量分離獲取，平均每300ml抽吸脂肪組織中可得到2×108～6×108個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)，傳代后的細(xì)胞稱為脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞, 由于該細(xì)胞具有骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的多數(shù)特性，習(xí)慣上也把這種細(xì)胞稱為脂肪干細(xì)胞[10]。

圖5 傳代細(xì)胞CD44呈陽性表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，400×）

圖6 成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞油紅“O”染色

圖7 成骨誘導(dǎo)堿性磷酸酶組化染色陽性

圖8 成軟骨誘導(dǎo)Ⅱ型膠原染色陽性

圖9 成肌誘導(dǎo)肌漿球蛋白組化染色陽性

ADSCs是脂肪組織中的一種潛在細(xì)胞資源，具有一般ASCs的特點(diǎn)，在分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定和分化的方法上也與大多數(shù)干細(xì)胞相同，它們可以自我更新，繁殖產(chǎn)生更多的干細(xì)胞，同時(shí)也可以分化成各種各樣的祖細(xì)胞，后者又可進(jìn)一步成熟發(fā)展成許多有特定功能的細(xì)胞系[11-12]。目前已發(fā)現(xiàn)ADSCs的生長(zhǎng)特點(diǎn)有：①細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，胞漿和核仁豐富，呈平行或漩渦樣排列；②細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期的細(xì)胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%；③在胎牛血清存在的條件下，傳代培養(yǎng)的ADSCs每2～3d增殖1倍；④多次傳代(10～20代)后細(xì)胞增殖速度無明顯減慢，在傳代6次后細(xì)胞群體中出現(xiàn)衰老細(xì)胞，第15代細(xì)胞群體中衰老細(xì)胞約占15%[13]。ADSCs免疫表型：經(jīng)流式細(xì)胞儀分析CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49d、CD49e、CD54、CD55、 CD59、CD90、 CD105、CD117、CD146、CD166、STRO-1均為陽性，其中CD105、CD166和STRO-1被鑒定為多向分化潛能細(xì)胞的標(biāo)志分子，而CD31、CD34和CD45均為陰性，而且細(xì)胞表型與BMSCs的表型基本相同[14]。脂肪組織與骨髓在胚胎發(fā)育過程中均源自中胚層，因而有學(xué)者對(duì)ADSCs與BMSCs在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、多向分化能力、細(xì)胞衰老性等各方面進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者差異僅表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①來源及獲取方式：BMSCs需要骨穿，經(jīng)密度梯度離心方法獲得，量少，而ADSCs來自脂肪組織抽吸物，簡(jiǎn)單消化離心等步驟即可獲取，量大[15]；②細(xì)胞表面抗原：BMSCs與ADSCs在細(xì)胞表面表達(dá)的CD抗原大多一致，但表達(dá)的細(xì)胞粘附分子略有不同[16]；③體外培養(yǎng)方式：BMSCs體外培養(yǎng)時(shí)，血清質(zhì)量與來源對(duì)其生長(zhǎng)和增殖有較大影響，而ADSCs體外增殖和分化時(shí)并不需要添加特殊血清，且增殖速度快，不必進(jìn)行永生化處理就能獲得足夠的細(xì)胞用于移植[17]；④免疫標(biāo)記：ADSCs缺乏表達(dá)造血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記分子，如：CD3、CD4、CD11c、CD15、CD16、CD19、CD31、CD33、CD38、CD56、CD62p、CD104、CD144。ADSCs表達(dá)CD49d，不表達(dá)CD106，而BMSCs正好相反，表達(dá)CD106，不表達(dá)CD49d。另，由于ADSCs來自自體，具備免疫相容性，不會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)和倫理學(xué)問題，也無繼發(fā)傳染病風(fēng)險(xiǎn)。因此，AMSCs目前已被越來越多的學(xué)者認(rèn)為是理想的干細(xì)胞來源[2]。

隨著對(duì)于ASCs研究的不斷深入，皮下脂肪組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)也逐漸得以完善，國外報(bào)道的培養(yǎng)方法一般為經(jīng)酶消化脂肪組織后，加入NH4CL以裂解組織中的紅細(xì)胞，但裂解液不僅可以裂解紅細(xì)胞，同時(shí)會(huì)對(duì)干細(xì)胞造成一定的損傷。本實(shí)驗(yàn)在酶消化脂肪組織后，未加紅細(xì)胞裂解液，而是通過頻繁換液的方法去除細(xì)胞懸液中懸浮的紅細(xì)胞成分，同樣獲得了較高濃度的干細(xì)胞成分。而且，本實(shí)驗(yàn)分離出的成人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞多系定向誘導(dǎo)分化方法簡(jiǎn)單易行，又經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。由此可見，本實(shí)驗(yàn)方法不失為一種成人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)與鑒定研究的可取方法。

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