線果芥CpNSP5基因的克隆及表達分析

朱燕飛，陳全家，姚正培，張　杰，曲延英

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊830052)

干旱不僅影響植物的生長發(fā)育，同時影響作物的產(chǎn)量及品質(zhì)，干旱脅迫已成為作物減產(chǎn)、糧食危機最重要的非生物脅迫因素[1]。中國也是受干旱影響嚴重的國家之一。尤其是西北內(nèi)陸，年降水量少，農(nóng)業(yè)水資源緊張。因此，培育抗旱性強的作物品種可以緩解水資源緊張對作物減產(chǎn)的影響。

短命植物是指生長發(fā)育周期快，能在短時間內(nèi)完成生活史的一類植物[2]，一般為草本植物，而且多集中在十字花科[3]，大多生長在干旱、礫石、荒漠等地。由于特殊的環(huán)境氣候條件，短命植物的生長發(fā)育快、生活周期短、繁殖能力強、光合效率高等特點引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。近幾年，開始研究短命植物中的抗逆基因。

線果芥(ConringiaplanisiliquaL.)為十字花科線果芥屬短命植物，1年生、少數(shù)2年生草本。全世界有8種，產(chǎn)中歐、地中海及中亞地區(qū)，中國有1種，產(chǎn)新疆、西藏。線果芥染色體基數(shù)為7。生活周期為2～3個月。許春華[4]對線果芥進行干旱生理指標研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗旱性。陳琴等[5-6]對線果芥的HRD基因同源克隆，并轉(zhuǎn)化煙草發(fā)現(xiàn)CpHRD提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性。本實驗從前期干旱脅迫線果芥中通過mRNA差異顯示技術(shù)得到的414 bp核心片段，克隆得到一個與擬南芥NSP5(nitrile-specifier protein 5)相似性較高的基因。

芥子油苷(glucosinolate)是一類含氮、含硫的植物次生代謝產(chǎn)物，主要分布于十字花科植物。芥子油苷及其降解產(chǎn)物具有多種生化活性，使植物個體對食草動物和微生物病原體表現(xiàn)出抗性[7]。當(dāng)植物組織遭到破壞時，芥子油苷與黑芥子酶接觸后發(fā)生不可逆的水解反應(yīng)，通常先降解為葡萄糖和不穩(wěn)定的糖苷配基，后者在不同的條件下通過非酶化重組反應(yīng)，進一步生成異硫代氰酸鹽(isothiocyanate,ITC)、硫代氰酸鹽(thiocyanate)、腈類(nitrile)、環(huán)硫腈(epithionitrile)或唑烷-2-硫酮(oxazolidine-2-thione)等活性物質(zhì)[8-11]。腈特異蛋白(nitrile-specifier proteins，NSPs)屬于芥子油苷-黑芥子酶體系中的一類蛋白質(zhì)因子。它們間接地影響黑芥子酶對芥子油苷的分解作用，使水解產(chǎn)物從異硫氰酸鹽變?yōu)殡骖愇镔|(zhì)[12-13]。目前，對NSPs的其他生物學(xué)功能還不清楚，對于NSP的研究主要集中于模式植物擬南芥，其余植物中尚未有研究。NSP家族在擬南芥中有5個成員。

短命植物線果芥具有較強的抗逆性，因此，對其抗逆基因的發(fā)掘和克隆具有重要意義。本實驗室利用mRNA差異顯示技術(shù)，篩選得到NSP5核心片段，進行基因克隆及生物信息學(xué)分析，為線果芥的抗逆機制提供理論依據(jù)，為后續(xù)NSPs的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)，為植物的抗逆分子育種提供候選基因。

1　材料和方法

1.1　植物材料及處理方法

線果芥種子由本實驗室種植保存。挑選飽滿的線果芥種子播種在蛭石和營養(yǎng)土為1∶2的花盆中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25 ℃/23 ℃(晝/夜)，16 h 光照/8 h 黑暗，光強為8 000 Lx。選取3～4周齡植株用20% PEG-6000模擬干旱脅迫處理，200 mmol·L-1的NaCl模擬鹽脅迫處理，采集脅迫0、3、6、9、12和24 h的葉片樣品，每處理3個重復(fù)。-70 ℃保存，用于后續(xù)的RNA提取。

1.2　線果芥總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

線果芥總RNA提取用TIANGEN的TRNzol Total RNA Reagent進行提取，方法參照說明書。用紫外分光光度計檢測RNA的質(zhì)量和濃度，同時用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。OD260/280在1.9～2.0范圍內(nèi)，電泳條帶清晰，用于下一步的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄用賽默飛的M-MLV First strand cDNA合成試劑盒參照說明書進行。

1.3　CpNSP5基因全長cDNA的克隆

對本實驗室用mRNA差顯法獲得的414 bp核心片段，用Primer 5.0軟件設(shè)計5′-RACE引物。具體操作參照TaKaRa的5′ Full RACE 試劑盒進行。將擴增產(chǎn)物連入pMD19-T Vector (TaKaRa 公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌α感受態(tài)細胞進行菌落PCR，確認重組成功后，菌液送上海生工測序。用DNAMAN軟件進行序列拼接，得到cDNA全長序列。

得到拼接的cDNA全長序列后設(shè)計擴增該基因全長的引物，進行全長序列的克隆。以線果芥cDNA為模板，CpNSP5-F和CpNSP5-R為引物(表1)，利用高保真酶進行PCR擴增。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，72 ℃延伸10 min；30個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物切膠后用天根公司的膠回收試劑盒進行回收。將膠回收產(chǎn)物連入pMD19-T Vector (TaKaRa 公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行菌落PCR，確認重組成功后，菌液送上海生工測序。

本實驗所用引物(表1)由華大基因合成。菌液測序均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

表1　實驗中的引物及序列

1.4　CpNSP5基因生物信息學(xué)分析

對CpNSP5基因進行序列分析，采用DNAMAN軟件分析核苷酸序列。利用ExPASy (http://www.expasy.orgproteomics)數(shù)據(jù)庫中的ProtParam軟件推導(dǎo)氨基酸序列的分子量和理論等電點。用SOPMA軟件預(yù)測CpNSP5基因所編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用NCBI網(wǎng)站GenBank 數(shù)據(jù)庫的Blast程序，分析與其他植物的NSP蛋白家族成員的一致性并用Mega5進行系統(tǒng)進化分析。

1.5　干旱和鹽脅迫下CpNSP5 基因表達分析

使用7500 Fast Real-Time PCR System，用SYBR Green Ⅰ熒光染料法檢測線果芥幼苗在20% PEG-6000和200 mmol·L-1NaCl脅迫不同時間段的基因轉(zhuǎn)錄表達水平，反應(yīng)體系參照Fast SYBR Green Master Mix ABI Applied Biosystems試劑盒說明書進行配制，每個反應(yīng)3次重復(fù)。反應(yīng)體系中含有10 μL Fast SYBR Green Master Mix(2×)，引物各0.4 μL，稀釋的cDNA模板2 μL，滅菌水7.2 μL，總體系20 μL。反應(yīng)程序為95 ℃酶的激活20 s，95 ℃變性3 s，60 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后做溶解曲線以及利用2-ΔΔCt法[14]分析數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　CpNSP5基因克隆

通過Blast比對發(fā)現(xiàn)，該基因序列的3′端完整，設(shè)計5′-RACE引物，參照TaKaRa公司的5′-RACE試劑盒說明書進行克隆。擴增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果在2 000 bp和1 000 bp之間有單一條帶(圖1，A)。經(jīng)菌液PCR送測后，用Blast比對5′端序列，又用DNAMEN進行序列拼接，得到一個全長為1 313 bp cDNA全長序列，其中開放閱讀框(ORF)長966 bp。

A. 5′-RACE； B. 全長擴增圖1　CpNSP5 5′-RACE和cDNA全長擴增結(jié)果A. 5′-RACE; B. The amplified full-length cDNA; M. 2 kb DNA ladderFig.1　PCR products of 5′-RACE and the full-length cDNA of CpNSP5

以線果芥cDNA為模板，依據(jù)拼接得到的全長cDNA序列，設(shè)計基因特異引物CpNSP5-F和CpNSP5-R，用高保真酶進行PCR擴增得到了CpNSP5基因的全長cDNA(圖1，B)?；厥漳康钠尾⑦M行連接轉(zhuǎn)化后將陽性克隆測序，表明該序列與拼接序列相同并包含完整的ORF。

2.2　CpNSP5基因序列分析

序列比對發(fā)現(xiàn)其和擬南芥的AtNSP5相似性較高，命名為CpNSP5，該基因cDNA全長為1 228 bp，其中開放閱讀框長966 bp，5′-UTR長32 bp，3′-UTR長227 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG，共編碼321個氨基酸，具有一段AATAAA 的3′端轉(zhuǎn)錄終止信號(圖2)。

2.3　CpNSP5 蛋白的生物信息學(xué)分析

氨基酸序列比對結(jié)果顯示，該蛋白的結(jié)構(gòu)域與山崳菜(Eutremasalsugineum)的假想蛋白相似性高達92%，與琴葉擬南芥(Arabidopsislyratasubsp.lyrata)的含 Kelch 重復(fù)元件的蛋白質(zhì)(kelch repeat-containing protein)相似性為89%，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)的NSP5(nitrile specifier protein 5)蛋白相似性為86%。該蛋白的結(jié)構(gòu)域與Kelch1、Kelch3、Kelch6有相同的結(jié)構(gòu)域(圖4)，都屬于Kelch_3超家族。

下劃線部分表示非編碼區(qū)域；大寫字母表示所編碼的氨基酸序列圖2　CpNSP5基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列The under lined letters indicated the non-coding regions；The capital letters showed the deduced amino acids sequenceFig.2　The cDNA sequence of CpNSP5 and its deduced amino acid sequence

ProtParam 預(yù)測結(jié)果顯示，CpNSP5 編碼蛋白的分子量為35.034 5 kD，等電點為5.41，蛋白質(zhì)富含甘氨酸(Gly 13%)和纈氨酸(Val 10.2%)，含有少量的半胱氨酸(Cys 1.2%)和谷氨酰胺(Gln 1.2%)，不含有吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)。CpNSP5蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白二級結(jié)構(gòu)包含26個β-折疊，沒有α-螺旋，具有典型的Kelch repeat 結(jié)構(gòu)。

2.4　CpNSP5蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

為了解CpNSP5蛋白與其他物種中NSP蛋白的親緣關(guān)系，對CpNSP5與其他物種已知的NSP5蛋白家族成員進行了系統(tǒng)進化分析。用Blast 分析并用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，CpNSP5與白菜的親緣關(guān)系最近(圖3)。

CaNSP5.鷹嘴豆；GmNSP5.大豆； EgNSP5.巨桉；BrNSP5.白菜；CpNSP5.線果芥；AtNSP5.擬南芥；NtNSP5.茸毛煙草； StNSP5.馬鈴薯圖3　CpNSP5與其他植物NSP5蛋白的系統(tǒng)進化分析CaNSP5.Cicer arietinum; GmNSP5.Glycine max; EgNSP5.Eucalyptus grandis; BrNSP5.Brassica rapa；CpNSP5.Conringia planisiliqua L.；AtNSP5.Arabidopsis thaliana; NtNSP5.Nicotiana tomentosiformis; StNSP5.Solanum tuberosumFig.3　Phylogenetic analysis of CpNSP5 and members of NSP5 proteins from other plants

CpNSP5. 線果芥 ; AtNSP5.擬南芥(NP_568692.1)；BrNSP5-like.白菜(NP_568692.1); CaNSP5- like.鷹嘴豆(XP_004488809.1);EgNSP5. 巨桉(XP_010038322.1); GmNSP5. 大豆(XP_003531506.1);NtNSP5. 茸毛煙草(XP_009591051.1); StNSP5-like .馬鈴薯 (XP_006364810.1)圖4　線果芥CpNSP5氨基酸序列與其他植物NSP5同源比對CpNSP5. Conringia planisiliqua L.; AtNSP5.Arabidopsis thaliana (NP_568692.1)；BrNSP5-like.Brassica rapa (NP_568692.1); CaNSP5-like.Cicer arietinum(XP_004488809.1); EgNSP5.Eucalyptus grandis (XP_010038322.1); GmNSP5.Glycine max (XP_003531506.1); NtNSP5.Nicotiana tomentosiformis(XP_009591051.1); StNSP5-like .Solanum tuberosum (XP_006364810.1)Fig.4　Comparison of amino acids sequence of CpNSP5 and homologous proteins of other plants

大寫和小寫字母分別表示0.01和0.05水平差異性顯著圖5　線果芥CpNSP5基因在干旱和鹽脅迫下不同時間的表達Capital letters and normal letters indicate significant difference at 0.01 and 0.05, respectivelyFig.5　The expression of CpNSP5 at different time points under drought and salt stresses

2.5　CpNSP5基因的表達分析

本研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測了CpNSP5基因在20% PEG-6000和200 mmol· L-1NaCl處理條件下的表達情況，結(jié)果(圖5)顯示，CpNSP5 基因表達在不同處理時間均有不同程度的升高，在干旱脅迫下，除12 h有下降外，其余時間段都是升高趨勢，并在脅迫6 h達到最高值；在鹽脅迫24 h達到最高值。說明CpNSP5基因?qū)Ω珊岛望}都有不同程度的響應(yīng)。

3　討　論

線果芥屬于野生植物資源，利用本實驗室通過干旱脅迫下mRNA差異顯示技術(shù)篩選克隆得到的414 bp的核心片段，通過RACE技術(shù)克隆得到和擬南芥AtNSP5相似性較高的CpNSP5基因。結(jié)果表明NSPs參與植物的抗旱調(diào)節(jié)，不僅可以為植物的抗逆育種提供候選基因，同時也可以為NSPs的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

CpNSP5屬于芥子油苷—黑芥子酶系統(tǒng)中的其中1類蛋白質(zhì)因子，其余2類是硫氰酸鹽形成蛋白(thiocyanate-forming protein，TFP)和環(huán)硫指定蛋白(epithiospecifier protein，ESP)，這3類特異蛋白都可以通過和黑芥子酶結(jié)合改變芥子油苷降解產(chǎn)物可塑性，從而激活植物的防御系統(tǒng)[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)，外源施加芥子油苷降解產(chǎn)物可減輕非生物脅迫傷害，但其如何發(fā)揮功能尚不清楚[15-16]。

Blast比對結(jié)果顯示，CpNSP5基因與十字花科其他植物的NSP基因有較高的一致性。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，線果芥NSP5和白菜的NSP5同源性最高。目前已從擬南芥、大蒜芥、甘藍等植物中分離克隆到編碼3類特異蛋白的基因。3類蛋白與植物中其他功能蛋白相似性很低，而3類蛋白之間序列相似性在50%～80%。Kucherning等[11]研究發(fā)現(xiàn)ESP、TFP均由NSP分化而來，其分化始于3 600萬年前，早于十字花科各物種分化時間，這也說明3類蛋白為何具有較高的相似性。對CpNSP5的蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于硫氰酸鹽形成蛋白(thiocyanate forming protein )，推測線果芥中的NSPs家族分化相對擬南芥中的較快。

CpNSP5包含26個β-折疊，5個Kelch結(jié)構(gòu)域。Kelch 重復(fù)元件首次在果蠅的kelch ORF1 蛋白序列中被發(fā)現(xiàn)[17]，隨后在病毒、植物和哺乳動物等生物體中相繼被發(fā)現(xiàn)[18]，其在生物體內(nèi)具有多方面的重要功能。Kelch 重復(fù)結(jié)構(gòu)元件是由 44～56 個氨基酸長度的重復(fù)序列組成，其中有 8 個高度保守的氨基酸：1 個芳香族氨基酸殘基 + 4 個疏水性氨基酸殘基 + 2 個甘氨酸 + 另外 1 個芳香族氨基酸殘基。Kelch 結(jié)構(gòu)域是由3 到 7 個 Kelch 重復(fù)結(jié)構(gòu)元件組成，這種結(jié)構(gòu)能形成高度保守的蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)——β-propeller(螺旋槳)結(jié)構(gòu)[19]。

而包含有Kelch repeat結(jié)構(gòu)域的蛋白在一些生物進化過程中涉及[20]，同時Kelch結(jié)構(gòu)域在蛋白與蛋白的互作中發(fā)揮作用，3類蛋白中均含有3～4個重復(fù)的Kelch結(jié)構(gòu)域，這與3類特異蛋白能與黑芥子酶結(jié)合從而改變芥子油苷降解反應(yīng)途徑功能相一致。結(jié)構(gòu)域分析同時也發(fā)現(xiàn)，3類蛋白中只有NSP在N端含有1～2個JRL(jacalin-related lectin，木菠蘿素相關(guān)凝集素)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在NSP蛋白功能方面的影響及作用目前尚不清楚[19]。

利用qRT-PCR技術(shù)檢測CpNSP5基因在鹽和干旱脅迫下的表達情況，結(jié)果表明該基因在脅迫條件下有不同程度的升高，說明該基因在植物的抗逆過程中發(fā)揮作用，這也為NSPs在生物中的其他生物學(xué)功能研究提供理論依據(jù)。其中，對于NSP的研究主要集中于模式植物擬南芥，上述特異蛋白中部分已成功在體外表達純化，進行了相關(guān)活性的研究[21-23]。

CpNSP5只是NSP基因家族的一個基因，其具體在線果芥中的生物學(xué)功能及抗逆機制都需要進一步的研究。

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