中間錦雞兒WRKY75基因?qū)M南芥耐受鹽和ABA能力的影響

萬永青，毛銘銖，萬東莉，柳金華，王光霞，李國婧，王瑞剛*

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草原研究所，呼和浩特 010010；3 內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；4 農(nóng)業(yè)部草地生態(tài)與修復(fù)治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010010)

鹽堿和干旱等非生物脅迫是造成農(nóng)作物等減產(chǎn)的主要原因之一[1]。內(nèi)蒙古地區(qū)處干旱半干旱區(qū)域，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的干旱、低溫和鹽堿化問題比較突出。中間錦雞兒(Caraganaintermedia)屬于豆科(Fabaceae)錦雞兒屬(Caragana)蝶形花亞科 (Papilionoideae)植物，與小葉錦雞兒、檸條錦雞兒親緣關(guān)系較近[2]，統(tǒng)稱為檸條，分布于山西、陜西、寧夏及內(nèi)蒙古自治區(qū)等省、區(qū)。檸條是典型的旱生植物，生態(tài)適應(yīng)性極強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于生態(tài)修復(fù)工程。檸條抗旱、抗寒、耐鹽堿、耐瘠薄，因此對(duì)其耐逆境的分子機(jī)制研究逐漸成為熱點(diǎn)。對(duì)中間錦雞兒和檸條錦雞兒在不同逆境處理?xiàng)l件下的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選[3-4]，為研究錦雞兒屬植物的基因功能奠定了重要基礎(chǔ)。在煙草中過量表達(dá)中間錦雞兒miR2118能增強(qiáng)植物的耐旱能力，并改變植物正常形態(tài)的建成[5]。在擬南芥中過量表達(dá)中間錦雞兒CiNAC3和CiNAC4，增強(qiáng)了植物對(duì)鹽脅迫的耐受能力[6]。中間錦雞兒CiDHN1的表達(dá)受冷、脫水和NaCl等非生物脅迫的誘導(dǎo)，在擬南芥過量表達(dá)CiDHN1后，其中表達(dá)量最強(qiáng)的株系表現(xiàn)出對(duì)NaCl處理敏感的表型[7]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子家族之一，是信號(hào)網(wǎng)絡(luò)不可缺少的部分，調(diào)節(jié)許多植物生物學(xué)進(jìn)程，例如防御反應(yīng)、衰老和非生物脅迫響應(yīng)等[8]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子最典型的特征就是其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一般由約60個(gè)氨基酸組成，靠近N-端含有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK，在C-端含有一個(gè)非典型的鋅指結(jié)構(gòu)(CX4-5CX22-23HXH或者 CX7CX23HXC)[8]。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指的結(jié)構(gòu)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可分為三大類：第Ⅰ類，含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2(CX4-5CX22-23HXH)型；第Ⅱ類，含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2(CX4-5CX22-23HXH)型，第Ⅱ類又可以分為a、b、c、d和e 5個(gè)亞族；第Ⅲ類，含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC(CX7CX23HXC)型[9]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)的表達(dá)受各種環(huán)境因子誘導(dǎo)，包括各種非生物和生物脅迫[10-14]。在擬南芥中表達(dá)對(duì)干旱響應(yīng)的小麥TaWRKY1和TaWRKY33增強(qiáng)了擬南芥對(duì)干旱和熱的抵抗能力[15]。CmWRKY1通過調(diào)節(jié)ABA相關(guān)基因而增強(qiáng)菊花的耐旱能力[16]。AtWRKY53通過調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)而負(fù)調(diào)節(jié)擬南芥對(duì)干旱的耐受能力[17]。擬南芥功能獲得型突變體adt中通過激活表達(dá)AtWRKY57而賦予了擬南芥抗旱的能力[18]。擬南芥中表達(dá)野生大豆的WRKY20增強(qiáng)了植物的耐旱能力[19]。水稻的2個(gè)等位基因OsWRKY45-1和OsWRKY45-2在ABA信號(hào)途徑和對(duì)鹽的適應(yīng)上的作用不同，OsWRKY45-2過表達(dá)株系增強(qiáng)了對(duì)ABA的敏感性、減弱了對(duì)鹽的耐受能力，而OsWRKY45-1過表達(dá)株系對(duì)ABA的敏感性減弱，同時(shí)對(duì)鹽的耐受性與對(duì)照相比無明顯區(qū)別[20]。此外，OsWRKY45-1和OsWRKY45-2均負(fù)調(diào)節(jié)水稻對(duì)冷和干旱脅迫的響應(yīng)[20]。過量表達(dá)AtWRKY25和AtWRKY39均提高了擬南芥對(duì)熱脅迫的耐受能力[21-22]。AtWRKY6和AtWRKY42通過調(diào)節(jié)PHO1的表達(dá)而參與擬南芥對(duì)低磷的響應(yīng)[23]。過量表達(dá)OsWRKY74增強(qiáng)了水稻對(duì)磷饑餓的耐受性[24]。過量表達(dá)OsWRKY89增強(qiáng)了水稻對(duì)紫外輻射的耐受能力[25]。AtWRKY70和AtWRKY54通過調(diào)節(jié)氣孔開度而參與擬南芥對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)[26]。

本研究在中間錦雞兒干旱轉(zhuǎn)錄組庫中，篩選、克隆到了1個(gè)CiWRKY75基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位研究，并在擬南芥中過量表達(dá)CiWRKY75對(duì)其在植物抵抗鹽和ABA處理中的功能進(jìn)行探討，以期為中間錦雞兒耐逆境脅迫的分子機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)支持。

1　材料和方法

1.1　植物材料、菌體和載體

中間錦雞兒的種子于2014年采自內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗(111.69°E, 41.44°N)。擬南芥Columbia-0(Col-0)野生型種子由實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌GV3101均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。連接載體pEASY-Blunt Simple購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)載體pCambia1302和pCanG-HA由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所謝旗研究員惠贈(zèng)。

1.2　方　法

1.2.1中間錦雞兒培養(yǎng)及脅迫處理選取均一飽滿的中間錦雞兒種子播種于裝有蛭石和營養(yǎng)土(2∶1)的培養(yǎng)缽中，置于溫室，溫度23～25 ℃、16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)。生長25 d后選取長勢一致的中間錦雞兒幼苗用作鹽和ABA處理。處理前將中間錦雞兒幼苗小心地從培養(yǎng)缽中取出，洗凈根上的土和蛭石，并浸入水中生長2 d后，分別浸于300 mmol/L NaCl溶液和100 μmol/L ABA溶液中[27]，在處理的0、1、3、6、9、12、24和48 h取樣。每個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)取3株植物混合作為后續(xù)檢測的樣品，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2總RNA提取和cDNA合成利用Trizol試劑提取中間錦雞兒地上組織總RNA，方法詳見文獻(xiàn)[6]。cDNA的合成使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)，具體步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.2.3基因全長克隆及進(jìn)化樹構(gòu)建依據(jù)中間錦雞兒WRKY75基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因全長擴(kuò)增引物CiWRKY75-HA-F/CiWRKY75-HA-R (表1)，并以中間錦雞兒cDNA為模板，通過PCR技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，用膠回收試劑盒(百泰克)回收目的PCR產(chǎn)物，并與pEASY-Blunt Simple載體(全式金)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過藍(lán)白斑篩選挑取單菌落利用M13引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。利用DNAMAN7分析CiWRKY75的ORF序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列，采用NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)CiWRKY75的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。利用NCBI blastp對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，選取相關(guān)序列，運(yùn)用MEGA6軟件進(jìn)行align，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)為1 000次。

1.2.4CiWRKY75與GFP融合表達(dá)載體構(gòu)建以中間錦雞兒的cDNA為模板，利用引物 CiWRKY75-GFP-F/CiWRKY75-GFP-R(表1)對(duì)目的基因CiWRKY75進(jìn)行擴(kuò)增，與克隆載體pEASY-Blunt Simple連接后，將陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序驗(yàn)證正確后，利用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ/SpeⅠ(Thermo Fisher Scientific)將目的基因切下，通過T4連接酶(Thermo Fisher Scientific)將目的基因和同樣經(jīng)過NcoⅠ/SpeⅠ酶切過的pCambia1302載體(含有35S啟動(dòng)子)相連接，獲得CiWRKY75與GFP融合表達(dá)載體35S∷CiWRKY75-GFP。

1.2.5亞細(xì)胞定位將重組質(zhì)粒35S∷CiWRKY75-GFP轉(zhuǎn)入到擬南芥原生質(zhì)體，擬南芥原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化方法參考Yoo等的方法[28]。利用熒光顯微鏡(Zeiss)對(duì)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的原生質(zhì)體進(jìn)行GFP熒光信號(hào)觀察。

1.2.6不同脅迫下CiWRKY75基因表達(dá)分析利用羅氏LightCycler 480 Real-Time PCR System，TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為：SYBR Ⅱ 10 μL，正、反向引物各0.4 μL (10 μmol/L)，cDNA模板(反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA原液稀釋16倍)5 μL，DEPC水4.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。

采用2-ΔΔCT法對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行分析。以中間錦雞兒的CiEF1α為內(nèi)參基因。每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。引物序列見表1。

1.2.7CiWRKY75過量表達(dá)載體構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化利用限制性內(nèi)切酶SalⅠ/SpeⅠ(Thermo Fisher Scientific)將1.2.3中測序驗(yàn)證的陽性克隆質(zhì)粒中的目的基因片段切下，并通過T4連接酶將目的基因與經(jīng)過相同酶切過的pCanG-HA表達(dá)載體(含有35S啟動(dòng)子)相連接，獲得重組表達(dá)載體35S∷CiWRKY75。利用電轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101中。采用浸花法[29]轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。采用卡那霉素抗性篩選法對(duì)轉(zhuǎn)基因純合體植株進(jìn)行篩選。篩選獲得T3代純合體植株后，利用基因特異性引物CiWRKY75-F/CiWRKY75-R，通過qRT-PCR對(duì)CiWRKY75在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量進(jìn)行檢測。以擬南芥AtEF1α基因作為內(nèi)參(表1)，采用2-ΔΔCT法對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行分析。

表1　PCR引物

1.2.8擬南芥脅迫處理(1)萌發(fā)率檢測：將轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥種子用酒精滅菌后播種于1/2 MS、分別含有200 mmol/L NaCl或2 μmol/L ABA的1/2 MS培養(yǎng)基平板上，4 ℃黑暗春化3 d后置于溫室培養(yǎng)，并進(jìn)行萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)，每天統(tǒng)計(jì)1次萌發(fā)率。每處理3個(gè)重復(fù)，共進(jìn)行3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(2)鹽脅迫處理：將轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥種子用酒精滅菌后播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，4 ℃黑暗春化3 d后置于溫室培養(yǎng)。待長出2片真葉后，移至浸透營養(yǎng)液的蛭石與營養(yǎng)土為2∶1的混合土中繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，澆200 mmol/L NaCl溶液進(jìn)行耐鹽脅迫處理，共澆3次(每次間隔4～5 d)。培養(yǎng)溫度23～25 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗。每個(gè)處理進(jìn)行3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1　CiWRKY75基因克隆鑒定

從中間錦雞兒干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得注釋為CiWRKY75的基因片段1 087 bp，NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因具有完整的開放閱讀框(ORF)。根據(jù)該基因ORF序列設(shè)計(jì)特異性引物，以中間錦雞兒cDNA為模板，對(duì)CiWRKY75基因進(jìn)行特異擴(kuò)增(圖1)，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序結(jié)果顯示克隆得到的CiWRKY75基因ORF序列長為570 bp，編碼189個(gè)氨基酸(圖2)。

2.2　CiWRKY75的保守結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化樹分析

采用NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)CiWRKY75的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。結(jié)果(圖2)顯示，CiWRKY75具有一個(gè)WRKY基序(WRKYGQK)和一個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)(CX4CX23HXH)。將CiWRKY75氨基酸序列在NCBI進(jìn)行相似性比對(duì)分析，結(jié)果顯示CiWRKY75與已經(jīng)鑒定的豆科植物蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的WRKY(XP_013447931)和大豆相似性分別達(dá)到76%(序列覆蓋率為98%)和73%(序列覆蓋率為100%)；與擬南芥的AtWRKY75和AtWRKY45相似性分別為87%和78%，序列覆蓋率均為48%。

為了進(jìn)一步分析CiWRKY75與其他物種同源WRKY的進(jìn)化關(guān)系，選取擬南芥、大豆、蒺藜苜蓿、鷹嘴豆和二穗短柄草等物種的WRKY蛋白，利用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，聚類分析結(jié)果顯示，中間錦雞兒WRKY75與蒺藜苜蓿WRKY、大豆WRKY75和木豆WRKY75聚到一起，表明其親緣關(guān)系比較近。

M. DL2000；1.CiWRKY75 ORF圖1　PCR克隆CiWRKY75Fig.1　The electrophoresis of the cloned CiWRKY75 using PCR

方框表示保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，圓圈表示鋅指結(jié)構(gòu)圖2　CiWRKY75的ORF序列及推導(dǎo)的氨基酸序列The box indicates conserved WRKY domain, the circles indicate zinc finger motifsFig.2　The ORF and deduced amino acid sequences of CiWRKY75

進(jìn)化樹采用鄰近法構(gòu)建，Bootstrap值設(shè)為1 000次圖3　CiWRKY75的系統(tǒng)進(jìn)化樹The phylogenetic tree is constructed using the neighbor joining method, Bootstrap values based on 1 000 replicationsFig.3　The phylogenetic tree of CiWRKY75

圖4　擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中35S∷CiWRKY75-GFP的亞細(xì)胞定位Fig.4　The nuclear localization of 35S∷CiWRKY75-GFP in Arabidopsis thaliana mesophyll protoplast

2.3　CiWRKY75的亞細(xì)胞定位研究

為了研究CiWRKY75亞細(xì)胞水平定位，將CiWRKY75的cDNA與GFP報(bào)告基因相融合構(gòu)建35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的重組表達(dá)載體35S∷CiWRKY75-GFP，并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥原生質(zhì)體，培養(yǎng)約16 h后進(jìn)行GFP熒光信號(hào)觀察。結(jié)果(圖4)顯示，對(duì)照空載體35S∷GFP的熒光信號(hào)遍布整個(gè)細(xì)胞，而35S∷CiWRKY75-GFP的熒光信號(hào)只在細(xì)胞核觀察到，這與轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核表達(dá)的規(guī)律相符合。

2.4　CiWRKY75基因?qū)}脅迫和ABA處理響應(yīng)的表達(dá)分析

為了研究CiWRKY75對(duì)鹽脅迫和ABA處理的響應(yīng)情況，利用qRT-PCR檢測了高鹽和ABA處理下中間錦雞兒中CiWRKY75基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，高鹽脅迫能強(qiáng)烈誘導(dǎo)CiWRKY75基因的表達(dá);在鹽處理1 h時(shí)，CiWRKY75基因明顯被誘導(dǎo)表達(dá)，是對(duì)照的2.7倍;隨著處理時(shí)間的延長，CiWRKY75基因的表達(dá)量增強(qiáng)，在48 h表達(dá)量是對(duì)照的215.6倍。在ABA處理下，與對(duì)照相比，CiWRKY75基因在1 h被誘導(dǎo)表達(dá)，在6 h達(dá)到峰值,是對(duì)照的2.9倍 (圖5)。表明CiWRKY75基因可能參與了中間錦雞兒對(duì)鹽和ABA響應(yīng)的分子信號(hào)途徑。

2.5　過量表達(dá)CiWRKY75減弱了擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐受能力

為了進(jìn)一步研究CiWRKY75在擬南芥對(duì)逆境脅迫響應(yīng)中的功能，構(gòu)建了35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的CiWRKY75重組表達(dá)載體35S∷CiWRKY75，并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，通過卡那霉素抗性篩選轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)孟德爾遺傳定律，T2代植物中符合3∶1(抗性苗∶非抗性苗)分離規(guī)律的轉(zhuǎn)基因株系被認(rèn)為是單拷貝插入，并繼續(xù)用于T3代純合體篩選，最終篩選獲得15個(gè)CiWRKY75過量表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)基因純合體株系(CiWRKY-OE1至OE15)。利用qRT-PCR對(duì)過表達(dá)株系中CiWRKY75的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(圖6)，結(jié)果顯示CiWRKY75在15個(gè)過表達(dá)株系中均有不同程度的表達(dá)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇過表達(dá)株系OE3、OE5和OE6作為研究材料。

為了檢測CiWRKY75過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽的耐受能力，進(jìn)行了萌發(fā)率和4周苗齡植物對(duì)鹽的耐受力檢測實(shí)驗(yàn)。萌發(fā)率檢測結(jié)果顯示(圖7)，在正常的1/2 MS培養(yǎng)基上，野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因擬南芥沒有區(qū)別，在萌發(fā)的第4天萌發(fā)率均達(dá)到100%。在含有200 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，與WT相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率降低，在萌發(fā)的第10天，WT的萌發(fā)率為80%，OE3、OE5和OE6的萌發(fā)率分別為69.6%、61.4%和65.9%。對(duì)4周苗齡的植物澆200 mmol/L NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理，以正常澆水作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖8)，在正常條件下WT和轉(zhuǎn)基因植物沒有明顯的區(qū)別；在鹽脅迫條件下，與WT相比，轉(zhuǎn)基因植物葉子萎蔫發(fā)白，表現(xiàn)出不耐鹽的表型。以上研究表明過量表達(dá)CiWRKY75降低了擬南芥對(duì)鹽的耐受性。

圖5　qRT-PCR檢測鹽和ABA處理下中間錦雞兒中CiWRKY75的表達(dá)模式Fig.5　The expression patterns of CiWRKY75 in C. intermedia under salt and ABA treatments examined by qRT-PCR

圖6　過表達(dá)株系中CiWRKY75的表達(dá)Fig.6　The expression levels of CiWRKY75 in the CiWRKY75 over-expression lines

圖7　鹽脅迫下野生型擬南芥和CiWRKY75過表達(dá)株系的萌發(fā)率檢測Fig.7　The germination rate of wild-type Arabidopsis and CiWRKY75 over-expression lines under salt treatment

圖8　CiWRKY75過表達(dá)株系對(duì)鹽的耐受能力檢測Fig.8　Salt tolerance examination of CiWRKY75 over-expression lines

圖9　ABA處理下野生型擬南芥及其CiWRKY75過表達(dá)株系的萌發(fā)率檢測Fig.9　The germination rate of wild-type Arabidopsis thaliana and CiWRKY75 over-expression lines under ABA treatment

2.6　過量表達(dá)CiWRKY75增強(qiáng)了ABA對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的抑制作用

將CiWRKY75轉(zhuǎn)基因擬南芥播種于含有2 μmol/L ABA的1/2 MS培養(yǎng)基平板上，以正常1/2 MS培養(yǎng)基作為對(duì)照，進(jìn)行ABA抑制的種子萌發(fā)檢測實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在正常1/2 MS培養(yǎng)基平板上，野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因株系OE5和OE6的萌發(fā)率沒有明顯的區(qū)別，在萌發(fā)后的第2天均達(dá)到98%以上。在含有2 μmol/L ABA的培養(yǎng)平板上，與WT相比，轉(zhuǎn)基因株系OE5和OE6的萌發(fā)率明顯被抑制，在萌發(fā)的第5天，WT的萌發(fā)率為25.9%，而OE5和OE6分別為10.3%和9.6%(圖9)。表明ABA對(duì)過量表達(dá)CiWRKY75擬南芥種子萌發(fā)的抑制作用增強(qiáng)。

3　討　論

目前，在不同植物中已發(fā)現(xiàn)了大量的WRKY家族成員。例如擬南芥中鑒定了72個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子[11]，水稻中103個(gè)[12]，葡萄中80個(gè)[30]，大豆中182個(gè)[31]，蘋果127 個(gè)[32]，二穗短柄草86個(gè)[33]，木薯85個(gè)[34]，蘿卜95個(gè)[35]。本課題組對(duì)中間錦雞兒的一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼基因CiWRKY2進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，基因表達(dá)模式檢測表明干旱、鹽堿、高溫、低溫和ABA處理均能誘導(dǎo)其表達(dá)，推測CiWRKY2可能參與了中間錦雞兒對(duì)逆境脅迫響應(yīng)的分子信號(hào)途徑[36]。此外，楊杞等對(duì)檸條錦雞兒一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子CkWRKY1進(jìn)行了克隆和干旱脅迫下的表達(dá)分析[37]。本研究對(duì)從中間錦雞兒干旱轉(zhuǎn)錄組文庫中獲得的一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼基因CiWRKY75，進(jìn)行了克隆鑒定分析。通過保守結(jié)構(gòu)域分析顯示CiWRKY75包含一個(gè)典型的“WRKYGQK”基序和一個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于第II類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，在擬南芥的WRKY基因家族中AtWRKY75與CiWRKY75的相似度最高。擬南芥中，AtWRKY75是磷饑餓信號(hào)途徑的正調(diào)控因子，是根發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子[38-39]。但是中間錦雞兒CiWRKY75是否參與磷信號(hào)和影響根的發(fā)育有待于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

基因表達(dá)模式檢測結(jié)果顯示CiWRKY75對(duì)鹽脅迫處理響應(yīng)強(qiáng)烈，進(jìn)一步的研究表明過量表達(dá)CiWRKY75基因降低了擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐受能力，在種子萌發(fā)期間過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比在200 mmol/L NaCl培養(yǎng)平板上的萌發(fā)率降低，表明CiWRKY75是植物響應(yīng)鹽信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子。但是CiWRKY75是如何起作用的？通過調(diào)節(jié)哪些基因而參與到鹽信號(hào)途徑中的？具體的分子機(jī)制還不清楚。

根據(jù)已有研究，不同的WRKY在植物抵抗鹽等逆境脅迫信號(hào)途徑中的作用不同，并且一個(gè)WRKY可能參與多種逆境脅迫途徑。例如在擬南芥中過量表達(dá)大豆GmWRKY13和GmWRKY54基因后發(fā)現(xiàn)，GmWRKY54過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物提高了對(duì)干旱和鹽害的忍耐性，而GmWRKY13過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株則對(duì)鹽害和甘露醇脅迫表現(xiàn)出了易感的表型并對(duì)ABA的敏感性降低[10]。過量表達(dá)MtWRKY76增強(qiáng)蒺藜苜蓿抗旱和耐鹽能力[40]。棉花GhWRKY41正調(diào)節(jié)干旱和鹽脅迫，在煙草中過表達(dá)GhWRKY41增強(qiáng)植物對(duì)干旱和鹽的耐受性[41]。煙草中過表達(dá)GhWRKY25導(dǎo)致植物對(duì)干旱耐受力減弱、對(duì)鹽的耐受力增強(qiáng)[42]。我們?cè)谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)，CiWRKY75除了對(duì)鹽脅迫處理有響應(yīng)，對(duì)ABA處理也有響應(yīng)。在ABA處理下，CiWRKY75過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物的種子萌發(fā)率明顯低于野生型擬南芥，表明過量表達(dá)CiWRKY75增強(qiáng)了ABA對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的抑制作用，CiWRKY75正調(diào)控ABA抑制的種子萌發(fā)。但在幼苗的生長過程中CiWRKY75是否影響根的伸長，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。綜合以上研究結(jié)果，作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，CiWRKY75具體是如何通過調(diào)控其下游的基因而參與逆境脅迫響應(yīng)分子途徑的，是我們下一步重點(diǎn)展開的研究內(nèi)容。

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