手足口病檢測(cè)中應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用效果

劉麗，羅瀅娟，李瓊，羅青，周信云，朱端昊

（吉安市疾病預(yù)防控制中心，江西 吉安 343000）

手足口病主要是指由腸道病毒引起的傳染性疾病，主要發(fā)生于5周歲以下的幼兒[1]，臨床癥狀主要表現(xiàn)為厭食、口痛、低熱、手部、足部及口腔等部位出現(xiàn)小潰瘍及小皰疹，嚴(yán)重影響患兒的生長(zhǎng)發(fā)育，大部分患兒在一周內(nèi)會(huì)自行康復(fù)，但少數(shù)患兒會(huì)引起肺水腫、心肌炎及無(wú)菌性腦膜炎等并發(fā)癥現(xiàn)象[2]，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。2014～2016年吉安市轄區(qū)內(nèi)13個(gè)縣市區(qū)送來的疑似手足口病例經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)病人群主要集中在5周歲以下的幼兒，且年齡越小發(fā)病率越高，發(fā)病時(shí)間持續(xù)在1周以內(nèi)[3]，患兒發(fā)病的主要病原體以CoxA16及EV71感染為主?，F(xiàn)階段的手足口病僅僅是針對(duì)已經(jīng)出現(xiàn)疾病或癥狀的現(xiàn)象進(jìn)行醫(yī)治，不利于患兒的成長(zhǎng)及健康發(fā)育，因此，有效地檢測(cè)、預(yù)防及控制措施顯得尤為重要。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 了解2014年～2016年吉安市轄區(qū)內(nèi)13個(gè)縣市區(qū)送來的疑似手足口病例標(biāo)本87例作為觀察對(duì)象，87例手足口病患兒中男性患兒與女性患兒之間的比例為53:34，年齡1～5歲，平均年齡為（2.15±1.34）歲，其中出現(xiàn)低熱癥狀的患兒為41例，厭食癥狀的患兒50例，患兒手部、足部及口腔內(nèi)均出現(xiàn)不同程度的潰瘍及皰疹現(xiàn)象。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室檢查后發(fā)現(xiàn)確診患兒為87例。

排除標(biāo)準(zhǔn)：存在嚴(yán)重器質(zhì)損傷及基礎(chǔ)性疾病的患兒、不同意進(jìn)行此次觀察的患兒（監(jiān)護(hù)人不同意）及嚴(yán)重精神障礙患兒；納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒年齡在5歲以下、患兒均存在不同程度的疑似手足口病的相關(guān)癥狀。

1.2 方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：取患兒咽拭子標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)溫后，按照試劑盒相關(guān)操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，分別進(jìn)行CoxA16、EV、EV71的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)及RT-PCR擴(kuò)增及逆轉(zhuǎn)錄，采用生物安全柜實(shí)時(shí)熒光PCR儀ABI7300；試劑盒：腸道病毒RNA檢測(cè)試劑盒，采用19 μl的檢測(cè)混合液，標(biāo)本5 μl，RT-PCR酶1μl反應(yīng)條件調(diào)整為：10min的45℃，15 min的95℃，15 s的95℃、1 min 60℃進(jìn)行操作，連續(xù)循環(huán)操作40次。手足口病病原體檢測(cè)試劑為通用型腸道病毒核酸檢測(cè)試劑盒，診斷標(biāo)準(zhǔn)為相關(guān)試劑盒的核酸檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果為主。

1.3 觀察指標(biāo) 將熒光定量PCR檢測(cè)的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，觀察實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確性、特異性及陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)室檢查對(duì)于檢測(cè)手足口病的陽(yáng)性率 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)室檢查對(duì)于診斷手足口病的檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 兩種檢測(cè)方式對(duì)于手足口病的檢測(cè)陽(yáng)性率比較（n）Table 1 Comparison of the positive rates of two kinds of detection methods for hand foot mouth disease(n)

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確性、特異性 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)診斷手足口病的敏感度為95.24%，特異度為75.00%，準(zhǔn)確性為93.10%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)與實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較見表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)與實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果對(duì)比Table 2 Comparison of real time fluorescence quantitative PCR detection and laboratory examination

3 討論

臨床報(bào)道指出：腸道病毒中的EV71病毒感染的患兒均伴隨較為嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥出現(xiàn)，具有較大的危害力及致死率，而CoxA16感染引起的手足口病預(yù)后較好，出現(xiàn)死亡現(xiàn)象及并發(fā)癥現(xiàn)象的可能性較低[4]。2014～2016年吉安市轄區(qū)內(nèi)13個(gè)縣市區(qū)出現(xiàn)的手足口病病例主要以5周歲以下的男性幼兒為主，且大部分患兒的發(fā)病時(shí)間集中在5～10月份[5]，發(fā)病持續(xù)時(shí)間為2～7 d左右，其中2～4歲的患兒發(fā)病率最高。隨著人們生活環(huán)境及細(xì)菌的滋生等現(xiàn)象，手足口病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，5周歲以上兒童發(fā)病率較少[6]，其顯著影響了患兒的正常發(fā)育及成長(zhǎng)。

腸道病毒感染引起的手足口病的潛伏期為一周內(nèi)左右，患兒出現(xiàn)感染癥狀后會(huì)獲得病毒的免疫力[7]，不同型別的病原感染后抗體不存在交叉保護(hù)作用[8]，手足口病的分布較為廣泛，一年中以夏秋季節(jié)較為多見，病毒的隱性感染較強(qiáng)，因此早期的檢測(cè)及診斷顯得尤為重要。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)手足口病的檢測(cè)陽(yáng)性率較低，且靈敏度不高，具有一定的局限性[9]；而實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)具有以下特點(diǎn)：分析檢測(cè)過程中由PCR儀完成操作，不需要進(jìn)行紫外燈及電泳的觀察，減少了操作的復(fù)雜過程，加快了檢測(cè)的進(jìn)程及速度[10]，提高了檢測(cè)的可靠性，在完全閉管的情況下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增反應(yīng)能有效減少或避免PCR產(chǎn)物的污染現(xiàn)象[7]；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的檢測(cè)時(shí)間較短，全程只需要3 h左右，將腸道病毒的檢測(cè)時(shí)間大大縮短，為手足口病的診斷提供了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室手段[11]，為臨床治療中對(duì)癥治療提供了參考依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)通過對(duì)CoxA16及EV71感染的病例進(jìn)行對(duì)比分析后得知，CoxA16及EV71感染引起的手足口病患兒在臨床癥狀及表現(xiàn)方面的差異較小，但CoxA16感染引起手足口病患兒的預(yù)后較好，且病情較輕；而EV71感染引起手足口病患兒的臨床癥狀較為嚴(yán)重，極易導(dǎo)致神經(jīng)源性肺水腫及腦干腦炎等并發(fā)癥的出現(xiàn)，嚴(yán)重的患兒甚至存在生命危險(xiǎn)，這一結(jié)果與臨床報(bào)道基本一致。因此，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)于診斷患兒病情及制定治療方案具有一定的積極作用。本次觀察的結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)于手足口病患兒的檢測(cè)陽(yáng)性率明顯較高，說明實(shí)時(shí)熒光定量RCP檢測(cè)的靈敏度及特異性較高，值得臨床檢驗(yàn)的推廣使用。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在手足口病檢測(cè)中的應(yīng)用效果較為顯著，能為疾病的預(yù)防與控制提供指導(dǎo)性數(shù)據(jù)。

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