專一脫硫菌催化氧化原油脫硫的研究

唐 瓊，徐嵐清，馮 昊，黎賢彬，孫佳欣，謝纖羽

( 樂山師范學(xué)院化學(xué)學(xué)院，四川 樂山 614000)

引 言

石油中的硫含量達(dá)2%以上［1］，而燃燒石油產(chǎn)品時所產(chǎn)生的SO2正是引起酸雨、PM2.5 超標(biāo)等一系列環(huán)境問題的主要污染物之一［2］。因此，原油的深度脫硫已成為世界急需解決的問題［3］。目前，工業(yè)上常用的脫硫方法是加氫脫硫，它是在金屬催化劑的作用下，通過高溫、高壓催化加氫將油中的有機(jī)硫轉(zhuǎn)化成H2S 而脫去。但此法運行條件苛刻，能耗高，且難以脫除雜環(huán)化合物中的硫［4-5］。近年來迅速發(fā)展起的生物脫硫技術(shù)是在不影響燃油固有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上選擇性脫除有機(jī)硫，它不影響燃油的熱值，且能夠有效脫除二苯并噻吩( Dibenzothiophene，DBT) 及其衍生物中的硫［6-7］，因此被認(rèn)為是21 世紀(jì)降低石油產(chǎn)品硫含量的有效途徑，越來越受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。

噻吩及其衍生物是石油中的主要含硫化合物，其含硫量占原油中有機(jī)硫總量的50% ～90%，而苯并噻吩和DBT 占噻吩類的70%以上，是含硫雜環(huán)化合物中最典型的代表［8］。此類物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，尤其是4位和6 位有取代基的DBT 系列，由于具有空間位阻效應(yīng)，是公認(rèn)的最難脫除的有機(jī)硫化物［9］。本文采用生物催化氧化對原油中含硫化合物DBT 進(jìn)行脫硫研究，著重探討微生物馴化富集、DBT 初始濃度、溫度、搖床轉(zhuǎn)數(shù)和微生物接種量等因素對生物催化脫硫效率的影響，并對氧化脫硫機(jī)理進(jìn)行了探討。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

純度為99%的二苯并噻吩( Sigma，中國) ; 正己烷、甲酸、乙腈、甲醇、甘油及培養(yǎng)基，均為分析純，產(chǎn)自成都市科龍化工試劑廠，用前沒有進(jìn)一步純化。

立式高壓滅菌鍋( YXQ－LS－50S11，博迅) ;高速離心機(jī)( TDZ4 －WS，Cence) ; ZP－A 搖床( 開元) ;PHS －3型pH 計( 雷磁) ;紫外－可見分光光度計( Jasco V －550 UV/vis，Jasco) ;高效液相色譜儀( LC －2010A HT，日本島津) ;氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀( ISQLT Single Quadrupole Mass Sepectrometer，TRACE 1310 Gas Chromatograph，Thermo．) 。

1.2 培養(yǎng)基的成分

經(jīng)過對培養(yǎng)基進(jìn)行分析比較，最后選用由2.44 g·L-1的KH2PO4，4.76 g·L-1的NaHPO4，0.4 g·L-1的MgCl2.6H2O，2.0 g·L-1的NH4Cl，1.0 mg·L-1的CaCl2.2H2O，1.0 mg·L-1的FeCl3.6H2O，4.0 mg·L-1的MnCl2.4H2O，10 g·L-1的甘油組成的無硫無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基( Basal Salts Medium，BSM)［10］。

1.3 微生物的馴化、富集

微生物的馴化富集以甘油為碳源，DBT 為硫源作為培養(yǎng)體系，過程如下:

取10 g 被石油污染的土壤與100 mL BSM，于250 mL錐形瓶中混合，再加入作為唯一硫源的DBT 乙醇溶液形成混合液，其中DBT 的終濃度為0.2 mmol·L-1。將裝有混合液的錐形瓶放在搖床上，在室溫下以200 rpm 的轉(zhuǎn)速進(jìn)行富集培養(yǎng)5 天，然后將混合液在4000 rpm 下離心10 min。取上清液5 mL，加入到裝有100 mL 新鮮BSM培養(yǎng)基和硫源的錐形瓶中，繼續(xù)富集培養(yǎng)5 天。再取上清液重復(fù)進(jìn)行富集培養(yǎng)，這樣重復(fù)培養(yǎng)4 次后，將所富集到的微生物培養(yǎng)液作為生物催化脫硫的微生物種子。

1.4 微生物脫硫?qū)嶒?/h3>

在250 mL 錐形瓶中，將一定量的培養(yǎng)基和DBT 溶液混合，并接種一定量的脫硫微生物。將裝有混合液的錐形瓶放在搖床上，在一定轉(zhuǎn)速和溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。7天后，取一定量的培養(yǎng)液用等體積的正己烷進(jìn)行萃取。將萃取后的有機(jī)相用高效液相色譜儀分析其中DBT 的濃度。每個樣品做三個平行樣。

1.5 分析檢測方法

(1) 菌液濃度由分光光度法在620 nm 下測定吸光度，用離心后的培養(yǎng)液做空白調(diào)零。依據(jù)吸光度及其和細(xì)胞干重繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計算得到菌液細(xì)胞干重，從而獲得細(xì)胞濃度。

(2) 用高效液相色譜儀( HPLC) 分析DBT 及其產(chǎn)物2 －羥基聯(lián)苯( 2 －HBP) 的濃度。將培養(yǎng)后的微生物混合液用等體積正己烷萃取，萃取后的有機(jī)相用HPLC 分析測定。分析條件:分離柱為XBridge－C18 柱(150 mm×4.6 mm，粒徑3.5 nm) ，柱溫30°C; 流動相為乙腈與0.2%甲酸的混合物( 兩者的比為6∶4) ，流速為1 mL/min。DBT 檢測波長為275 nm，進(jìn)樣量5.0 μL。

(3) 用GC－MS 分析氧化產(chǎn)物。GC 條件:進(jìn)樣口溫度320 ℃; 載氣為高純He，恒流模式，流速1 mL/min;1∶20分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL;色譜柱為TG－SQC ( Thermo PN 26070 －1300，30 m × 0.25 mm × 0.25 m ) ;柱升溫程序:初始溫度80 ℃，保持0.5 min，以40 ℃/min 的速率升溫至200 ℃，保持0.5 min，以5 ℃/min 的速率升溫至210 ℃，保持8 min，再以40 ℃/min 的速度升溫至300 ℃，保持2 min。MS 條件: 電子轟擊電離( EI) 源，電子能量70 eV;離子源溫度280 ℃，質(zhì)譜傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲時間5 min，掃描荷質(zhì)比范圍為為40 ～300。產(chǎn)物的鑒定采用GC－MS 中自帶的Nist －05 標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫，匹配度大于90%。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物馴化富集

微生物的馴化富集以甘油為碳源，DBT 為硫源。從被石油污染的土壤表面收集的微生物，在添加了DBT(0.2 mmol·L-1) 作為唯一硫源的BSM 中，經(jīng)一系列的培養(yǎng)、馴化后，微生物和DBT 的含量隨培養(yǎng)時間的變化如圖1 所示。

圖1 微生物和DBT 濃度隨培養(yǎng)時間的變化

從圖1 可知，隨著微生物濃度的增加，DBT 濃度下降，當(dāng)培養(yǎng)四天( 即96 小時) 時，培養(yǎng)液中DBT 濃度接近于零，此時微生物細(xì)胞濃度達(dá)到最大值，為5.57 g·L-1，由此表明微生物的生長與DBT 脫硫是一個相關(guān)過程，兩者是同時發(fā)生的，這說明微生物在生長繁殖的新陳代謝過程中，需要消耗DBT 中的硫源來滿足合成細(xì)胞機(jī)體對硫元素的需要。研究結(jié)果表明馴化富集到的微生物對DBT 的生物脫硫效果很顯著。

2.2 溫度對DBT 生物氧化脫硫的影響

在培養(yǎng)基體積為100 mL、DBT 終濃度為0.6 mmol·L-1、微生物接種量為5 mL、搖床轉(zhuǎn)速為200 rpm 的條件下，分別設(shè)置20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃的溫度梯度，培養(yǎng)7 天，考察培養(yǎng)溫度對DBT 生物脫硫效率的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 溫度對DBT 脫硫轉(zhuǎn)化的影響

從圖2 可知，微生物的脫硫效率隨著溫度的上升而先增加后降低，當(dāng)溫度升高到25 ℃時，DBT 的脫硫轉(zhuǎn)換率達(dá)到了最高，為90.74%; 但當(dāng)溫度繼續(xù)增加時，DBT的轉(zhuǎn)化率急劇下降，當(dāng)溫度為40 ℃時，DBT 的轉(zhuǎn)換率僅為32.53%。其主要原因是微生物的生長代謝與溫度息息相關(guān)，一般情況下，一定溫度范圍內(nèi)，微生物的酶活性隨溫度的升高而上升，但是當(dāng)溫度超過這一范圍后，會抑制酶的活性，從而降低催化效率，甚至使其失活。研究結(jié)果表明所篩選、富集出的微生物其酶活性最適溫度在25 ℃左右，低于此溫度，酶活性降低，而當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時，微生物的生長會受到嚴(yán)重的影響，從而降低DBT 的轉(zhuǎn)化率。

2.3 轉(zhuǎn)速對DBT 生物氧化脫硫的影響

在培養(yǎng)基體積為100 mL、DBT 終濃度為0.6 mmol·L-1、微生物接種量為5 mL、培養(yǎng)溫度為25 ℃的條件下，分別設(shè)置160 rpm、180 rpm、200 rpm 和220 rpm 的搖床轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)7 天，考察轉(zhuǎn)數(shù)對DBT 生物脫硫效率的影響，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 轉(zhuǎn)速對DBT 脫硫轉(zhuǎn)化的影響

從圖3 可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)數(shù)從160 rpm 增加到220 rpm的過程中，微生物對DBT 的脫硫轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先增加后輕微降低的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)速在180 rpm 時，DBT 轉(zhuǎn)換率達(dá)到了最高，為96.83%。其主要原因是搖床的轉(zhuǎn)速決定了培養(yǎng)基中溶解氧的含量，對于好養(yǎng)微生物，氧氣濃度的變化對生長代謝和催化速率有影響，但是水中溶解氧濃度是有上限的，達(dá)到這個上限后搖速再增加溶解氧也不會明顯增加;而另一方面，搖床轉(zhuǎn)數(shù)過高，錐形瓶里的液體在高速旋轉(zhuǎn)下產(chǎn)生較強(qiáng)的剪切作用力，這會影響微生物的生長代謝，從而導(dǎo)致脫硫效率不會繼續(xù)增加甚至略有降低。

2.4 微生物初始濃度對DBT 生物氧化脫硫的影響

在培養(yǎng)基體積為100 mL、DBT 終濃度為0.6 mmol·L-1、培養(yǎng)溫度為25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm 的條件下，分別接種0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL 和5.0 mL的生物富集培養(yǎng)物，培養(yǎng)7 天，考察微生物初始濃度對DBT 生物脫硫效率的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 微生物接種量對DBT 脫硫轉(zhuǎn)化的影響

從圖4 可知，接種量在0.5 mL 增加到3 mL 的過程中，脫硫效率逐漸上升，接種量為3.0 mL 時DBT 轉(zhuǎn)換率達(dá)到了最高，為95.01%，之后繼續(xù)增大接種量，轉(zhuǎn)化率略有波動。其主要原因是在接種量為0.5 mL ～3 mL時，微生物量隨著時間的增加呈幾何數(shù)增長，初始接種量越大，微生物濃度也就越高，所以催化效率也越高。而當(dāng)接種量超過3 mL 時，DBT 轉(zhuǎn)化率不再增加，這主要是因為:隨著反應(yīng)產(chǎn)物2 －羥基聯(lián)苯和的增加，整個體系的傳質(zhì)速率受到影響，從而影響反應(yīng)的正向進(jìn)行，使反應(yīng)速率降低［11］; 此外，還存在一些不確定的因素，比如微生物已經(jīng)利用完了碳源和其它營養(yǎng)物質(zhì)［12］，從而也會影響其生長代謝。

2.5 微生物脫硫機(jī)理的探討

為了考察微生物對DBT 氧化脫硫的機(jī)理，在最優(yōu)條件下，將脫硫微生物培養(yǎng)4 天，然后，用等體積正己烷萃取微生物混合液，將萃取后的有機(jī)相用GC －MS 分析測定。其色譜、質(zhì)譜圖分別如圖5、圖6 所示。

圖5 GC－MS 分析得到的氧化產(chǎn)物色譜圖

圖6 保留時間為7.11 min 和5.86 min 物質(zhì)的質(zhì)譜圖

從圖5、圖6 可知，從被油污染的土壤里通過篩選、馴化、富集得來的脫硫菌株能夠?qū)BT 催化氧化脫硫，最終產(chǎn)物為2 －羥基聯(lián)苯(2 －HBP) 。有研究表明，微生物脫除DBT 類硫需要4 種酶: DBT 單加氧酶( dszC) 、DBT 砜單加氧酶( dszA) 、黃素還原酶( dszD) 和HPBS脫硫酶的共同參與［13-14］。dszC 和dszA 的活力依賴于dszD。在dszD 的存在下，dszC 和dszA 將DBT 依次氧化為相應(yīng)的亞砜類( DBTO) 、砜類( DBTO2) 和磺酸鹽類( HPBS) ; dszB 進(jìn)一步將HPBS 氧化脫硫，生成2 －HBP和。其詳細(xì)脫硫途徑如圖7 所示。

從圖7 可知，在這一反應(yīng)過程中，噻吩類化合物只是作為硫源而不是碳源，微生物選擇性地攻擊DBT 中的C－S 鍵，使C－S 鍵斷裂，釋放出硫元素，生成油溶性的2 －羥基聯(lián)苯( 此物又回到油相) 。整個反應(yīng)中碳碳結(jié)構(gòu)不受到破壞，使得烴類化合物的碳骨架完好保存下來，從而最大限度地保留了石油產(chǎn)品的燃燒值。

圖7 生物催化DBT“4S”脫硫途徑

3 結(jié) 論

本文采用生物催化氧化，對原油中含硫化合物二苯并噻吩進(jìn)行了脫硫研究，著重探討了微生物馴化、富集，溫度，轉(zhuǎn)速和生物接種量等因素對生物催化脫硫效率的影響，并對其催化脫硫機(jī)理進(jìn)行了探討。結(jié)論如下:

(1) 以甘油作為碳源、DBT 作為唯一硫源的培養(yǎng)體系來馴化、富集得到的微生物能夠有效脫除DBT 分子中的硫元素，微生物生長和DBT 脫硫同時發(fā)生。

(2) 微生物的脫硫率隨培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、生物接種量的變化而不同。隨著培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速的增加，脫硫效率先增加后降低。生物接種量越大，脫硫效率越高，直至平緩。生物催化脫硫反應(yīng)條件優(yōu)化為: 溫度25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 rpm，生物接種量3 mL，使DBT 的脫硫率達(dá)到了95.01%。

(3) 微生物催化脫硫的機(jī)理是:催化反應(yīng)通過4S 途徑，將DBT 轉(zhuǎn)化成油溶性的2 －羥基聯(lián)苯( 2 －HBP) 并釋放出硫來，同時烴類化合物碳骨架得以保存完好，從而不影響原油的熱值。