寧夏甜瓜酒優(yōu)良酵母菌的篩選及鑒定

張春芝，莫寅斌，江志國，章洋

（寧夏葡萄酒與防沙治沙職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏銀川750199）

甜瓜（Cucumis melo L.）又稱洋香瓜，香瓜等，屬葫蘆科甜瓜屬，是一種世界性的重要水果。其果實(shí)汁多而味甜，具有濃郁的香氣，并含有大量人體所需的葡萄糖、維生素、有機(jī)酸及礦物質(zhì)；據(jù)測定，甜瓜果實(shí)干物質(zhì)含量6%～18.5%，其中總糖含量為4.6%～15.8%（包括葡萄糖2%～3.6%，果糖0.5%～3.6%，蔗糖1%～11.2%）；果酸0.054%～0.128%；果膠0.8%～4.5%；纖維素和半纖維素2.6%～6.7%；而且每100克甜瓜中含有維生素C 29 mg～39.1 mg。寧夏得天獨(dú)厚的光熱資源和區(qū)位優(yōu)勢，甜瓜產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展，已經(jīng)成為寧夏中部干旱帶的優(yōu)勢特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)。同時(shí)也為生產(chǎn)甜瓜酒，豐富酒類產(chǎn)品品種，提高產(chǎn)品的高附加值，奠定了扎實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)[1-2]。

酵母菌是甜瓜酒釀造過程中最重要的微生物，它不但影響發(fā)酵速度，也影響著甜瓜酒的品質(zhì)和風(fēng)格[3-5]。生產(chǎn)甜瓜酒一般都是利用商業(yè)酵母作為發(fā)酵菌株[6-7]，而選擇利用來源于甜瓜的酵母進(jìn)行甜瓜酒發(fā)酵報(bào)道不多[8-9]。本研究以自然發(fā)酵的甜瓜汁作為分離源進(jìn)行酵母菌的分離、純化與鑒定，得到適合釀造甜瓜酒的酵母菌株NT13。并對(duì)其釀酒特性進(jìn)行探索研究，為進(jìn)一步開展甜瓜酒的應(yīng)用和開發(fā)研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 樣品

選擇成熟度好的寧夏黃甜瓜，購自銀川市農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母膏胨葡萄糖(YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L（固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L）。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、磷酸二氫鉀0.055%、氯化鉀0.042 5%、氯化鈣0.012 5%、氯化鐵0.000 25%、硫酸鎂0.012 5%、硫酸錳0.000 25%、溴甲酚綠0.002 2%、瓊脂2%，pH 6.5；121℃滅菌20 min。

氯化三苯基四氮唑（TTC）培養(yǎng)基[10]：由上層培養(yǎng)基與下層培養(yǎng)基組成。其中TTC上層培養(yǎng)基：TTC 0.5 g/L、葡萄糖5 g/L、瓊脂15 g/L、現(xiàn)配現(xiàn)用；TTC下層培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏1.5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂0.4 g/L、檸檬酸0.3 g/L、瓊脂30 g/L。

甜瓜汁培養(yǎng)基：以甜瓜為原料制備的清汁，糖度為 18°Brix，100℃滅菌 10 min。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新悅-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；H.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；pHS-3C酸度計(jì)：上海虹益儀器廠；手持糖度計(jì)：上海米青科實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面潔凈工作臺(tái)：蘇潔凈化設(shè)備有限公司；DYCP-31DN DNA電泳槽：北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀：上海復(fù)日科技儀器有限公司；2720 thermal cycler PCR儀：Applied Biosystems公司；HC-2518R冷凍高速離心機(jī)：BBI公司；SP10-1000 Surf系列精密單道可調(diào)移液器：上海生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌的分離

取新鮮成熟度好的甜瓜，帶皮剁碎，稱取100 g裝入500 mL無菌三角瓶中，用無菌紗布蓋住瓶口，28℃培養(yǎng)2 d～3 d，待發(fā)酵醪液出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象后即可分離。將上述發(fā)酵醪液適當(dāng)稀釋，取0.2 mL涂布于YPD培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，28℃培養(yǎng)2 d～3 d。長出菌落后，挑取具有典型酵母菌菌落特征的單菌落采用劃線分離法進(jìn)一步純化。將純化后的酵母菌種置于4℃冰箱保藏。

1.3.2 酵母菌的初篩

將分離純化后的酵母菌株以劃線分離的方式接種到WL營養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行釀酒酵母的篩選，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d～5 d后，觀察菌落特征。

1.3.3 酵母菌的復(fù)篩

一級(jí)復(fù)篩：TTC顯色法對(duì)初篩得到的酵母菌株的產(chǎn)酒精能力進(jìn)行測定[11]。挑取紅色菌落進(jìn)行二級(jí)篩選。

二級(jí)復(fù)篩：利用杜氏管發(fā)酵法[12]，在同等條件下，將一級(jí)篩選得到的菌株進(jìn)行活化，以10%的接種量接入附有杜氏小管的甜瓜汁培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，每隔12 h觀察并記錄杜氏小管中產(chǎn)氣情況。選取起酵速度快且發(fā)酵能力強(qiáng)的菌株進(jìn)入三級(jí)篩選。

三級(jí)復(fù)篩：將二級(jí)篩選的菌株繼續(xù)培養(yǎng)1 d，由5位有品嘗經(jīng)驗(yàn)的教師組成的品評(píng)小組對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行感官評(píng)定酒的風(fēng)味（色澤、香氣等）。

1.3.4 菌株的生理生化特性試驗(yàn)

1.3.4.1 糖發(fā)酵鑒定[13]

分別用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、核糖、棉子糖進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)，菌株作3個(gè)重復(fù)。

1.3.4.2 同化碳源試驗(yàn)[13]

分別用D-半乳糖、蔗糖、麥芽糖、D-木糖、纖維二糖、海藻糖、D-核糖、檸檬酸、乳糖、L-鼠李糖、肌醇、D-甘露糖、山梨醇、菊糖代替YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖，菌株作3個(gè)重復(fù)。

1.3.5 菌株耐受性測定[14-15]

采用杜氏管發(fā)酵法，將篩選得到的菌株活化后分別以5%的接種量接種到不同含糖量（250、280、310、340、370、400、420 g/L）、不同乙醇含量（10%、12%、14%、15%、16%、17%和18%）、不同pH值（3.73、3.37、3.08、2.96、2.87、2.80 和 2.74）、不同 SO2濃度（120、160、200、230、250、280、300 mg/L） 的 10 mL 附有杜氏小管的滅菌甜瓜汁中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，觀察杜氏小管中氣體的高度，以未做處理的甜瓜汁培養(yǎng)基作對(duì)照。

1.3.6 酵母菌性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 菌株的產(chǎn)乙醇能力

甜瓜汁發(fā)酵法：將篩選得到的酵母菌株活化，以6%的接種量接種到200 mL滅菌甜瓜汁中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5 d，采用密度瓶法測定其乙醇體積分?jǐn)?shù)[16]。

1.3.6.2 菌株的生長曲線測定[17]

將篩選得到的酵母菌株接種到滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，觀察菌株的生產(chǎn)情況，前期間隔2 h取樣，后期間隔12 h取樣，用可見分光光度計(jì)在560 nm波長處測定吸光度，重復(fù)3次，繪制菌株的生長曲線。

1.3.7 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

采用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析對(duì)篩選出的酵母菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定[17]。將菌株平板送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測定的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中區(qū)域序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，分析該菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離

經(jīng)初步分離，共得到56株具有典型酵母菌菌落特征的菌株，分別記號(hào)為NT1～NT56。

2.2 酵母菌的初篩

通過WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的初步篩選，挑取菌落顏色為奶油色至綠色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀的單菌落，共篩選出23株。

2.3 酵母菌的復(fù)篩

2.3.1 一級(jí)篩選

通過TTC顯色反應(yīng)篩選出9株菌落顏色為紅色或深紅色的菌株 （圖 1），分別為 NT4、NT6、NT11、NT13、NT17、NT29、NT34、NT42、NT45，說明產(chǎn)酒精能力強(qiáng)。

圖1 TTC顯色反應(yīng)結(jié)果Fig.1 Yeast strain cultured in TTC chromogenic medium

2.3.2 二級(jí)篩選

將9株一級(jí)篩選的菌株接種到附有杜氏小管的甜瓜汁培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，觀察產(chǎn)氣情況，結(jié)果見表1。

表1 酵母菌的杜氏小管產(chǎn)氣情況Table 1 The produce gas of 9 yeast strains

由表1可知，有5株酵母產(chǎn)氣充滿杜氏小管，并能聞到淡淡的酒香，說明這些菌株具有較強(qiáng)的起酵能力和發(fā)酵力。

2.3.3 三級(jí)篩選

將5株二級(jí)篩選的菌株繼續(xù)培養(yǎng)1 d，進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果見表2。

表2 5株酵母菌株發(fā)酵甜瓜酒的感官評(píng)定Table 2 The sensory evaluation of 5 yeast strains fermented melon wine

經(jīng)過綜合評(píng)定，NT13菌株發(fā)酵的甜瓜酒，色澤金黃，酒香濃郁，果香典型性強(qiáng)，適合作為甜瓜酒發(fā)酵菌種。

2.4 菌株生理生化鑒定

將NT13菌株進(jìn)行進(jìn)一步生理生化鑒定，結(jié)果見表3。

表3 酵母NT13菌株利用碳源試驗(yàn)Table 3 The carbon sources tested of NT13

根據(jù)表3的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)比《真菌鑒定手冊》初步判斷NT13菌株為酵母屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

2.5 NT13菌株耐受性測定

2.5.1 耐糖量測定

試管中加入10 mL完全溶解的不同糖濃度的甜瓜汁培養(yǎng)基，滅菌后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，觀察杜氏小管的產(chǎn)氣高度，結(jié)果見表4。

由表4可知，NT13菌株在含糖量為40%左右，可以良好地生長，且香氣較好，符合果酒酵母的要求。

表4 NT13菌株在不同糖濃度下的生長情況Table 4 The effects of different sugar content to NT13

2.5.2 耐酒精測定

試管中加入10 mL甜瓜汁培養(yǎng)基，滅菌冷卻后分別加入食用酒精，搖勻后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，觀察杜氏小管的產(chǎn)氣高度，結(jié)果見表5。

表5 NT13菌株在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下的生長情況Table 5 The effects of different alcohol content to NT13

由表5可知，NT13菌株可以耐受17%vol的乙醇，符合一般發(fā)酵果酒10%vol～14%vol的乙醇含量的要求。

2.5.3 耐pH值測定

試管中加入10 mL以檸檬酸調(diào)整pH值后的甜瓜汁培養(yǎng)基，滅菌冷卻后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，觀察杜氏小管的產(chǎn)氣高度，結(jié)果見表6。

表6 NT13菌株在不同pH值下的生長情況Table 6 The effects of different pH to NT13

由表6可知，NT13菌株能夠在pH2.74的條件下存活，說明其耐酸能力可以達(dá)到果酒釀造要求。

2.5.4 耐SO2測定

試管中加入10 mL甜瓜汁培養(yǎng)基，滅菌冷卻后分別加入亞硫酸，搖勻后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，觀察杜氏小管的產(chǎn)氣高度，結(jié)果見表7。

表7 NT13菌株在不同質(zhì)量濃度SO2下的生長情況Table 7 The effects of different SO2concentrations to NT13

表7可知，NT13菌株有較強(qiáng)的SO2耐受能力，符合國標(biāo)中對(duì)于果酒中SO2的最大殘留量250 mg/L的要求。試驗(yàn)證明其在250 mg/L的條件下依然有較好的香氣。

2.6 NT13菌株性質(zhì)試驗(yàn)

2.6.1 產(chǎn)乙醇能力

根據(jù)GB 5009.225-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》酒精度的測定方法，采用第一法即密度瓶法進(jìn)行測定，結(jié)果見表8。

表8 NT13菌株產(chǎn)乙醇能力Table 8 The ethanol yield of NT13

將試驗(yàn)結(jié)果代入計(jì)算公式，查附錄A后可得出NT13菌株產(chǎn)乙醇約為10.9%vol。

2.6.2 生長曲線測定

NT13菌株的生長曲線見圖2。

由圖2可見，培養(yǎng)2 h后NT13菌株大量生長繁殖，菌量以指數(shù)級(jí)增加，10 h后達(dá)到最高值，之后趨于穩(wěn)定。這與文獻(xiàn)有關(guān)酵母生長曲線的報(bào)道一致[18]。

2.7 NT13菌株的分子生物學(xué)鑒定

2.7.1 NT13菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)鑒定結(jié)果

NT13菌株P(guān)CR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖見圖3，NT13菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)鑒定結(jié)果見表9。

圖2 NT13菌株的生長曲線Fig.2 The microbial growth curve of yeast NT13

圖3 NT13菌株P(guān)CR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.3 PCR products by agaros electrophoresis of yeast NT13

表9 NT13菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)鑒定結(jié)果Table 9 Identification result based on 26S rDNA D1/D2 of NT13

如圖3所示，NT13菌株的26S rDNA序列長度為594 bp。經(jīng)基因測序，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)（表9），結(jié)果表明NT13與酵母屬釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae相似性為100%，故將其鑒定為酵母屬釀酒酵母。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從寧夏黃甜瓜自然發(fā)酵醪中分離篩選出1株優(yōu)良酵母菌，該菌株產(chǎn)酒精能力和發(fā)酵能力強(qiáng)。經(jīng)感官鑒定，產(chǎn)果香酒香濃郁，典型性強(qiáng)。耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其能夠耐受40%的含糖量、18%的乙醇和300 mg/L的SO2含量，能夠在pH2.74的酸性條件下良好生長。通過密度瓶法測其能夠自然發(fā)酵產(chǎn)乙醇約為10.9%vol，生長曲線測定實(shí)驗(yàn)表明菌量在2 h后以指數(shù)級(jí)增加，10 h后趨于穩(wěn)定。經(jīng)生理生化鑒定及26S rDNA D1/D2鑒定為酵母屬釀酒酵母。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，NT13菌株符合一般果酒發(fā)酵的要求，可以應(yīng)用于甜瓜酒的釀造。但有關(guān)該酵母菌的發(fā)酵工藝特性還有待于進(jìn)一步研究。

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