家蠶細(xì)胞自噬和凋亡研究進(jìn)展

謝 昆，李密杰，蔣成硯，魯海菊，孔 瓊，高 波

(1.紅河學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 蒙自 661199；2.云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 蒙自 661199)

自噬(autophagy)和凋亡(apoptosis)是真核生物中廣泛存在的主動(dòng)或應(yīng)急代謝過(guò)程。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生物合成和分解代謝之間保持動(dòng)態(tài)平衡是維持細(xì)胞生存和發(fā)育的基本條件，也是細(xì)胞主動(dòng)響應(yīng)發(fā)育程序控制或應(yīng)急適應(yīng)環(huán)境變化的基本特征，平衡的破壞則造成腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞死亡，自噬和凋亡是維持這種動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵因素之一，是細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)機(jī)制中2個(gè)主要途徑[1,2]。在昆蟲(chóng)細(xì)胞中，對(duì)自噬和凋亡的研究相對(duì)較晚，昆蟲(chóng)細(xì)胞的自噬和凋亡調(diào)控與哺乳動(dòng)物和酵母之間既有相似的通路，也存在一套獨(dú)特的分子通路，如在果蠅當(dāng)中，βFTZ-F1、E93、BR-C、E74A等次級(jí)轉(zhuǎn)錄因子參與到自噬和凋亡的調(diào)控中，它們除了發(fā)揮對(duì)凋亡誘導(dǎo)因子Reaper、Hid和Grim的表達(dá)行駛正調(diào)控的功能外，還具有誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生高水平的自噬的雙重功能。當(dāng)E93、BR-C、E74A誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能受阻后，它們?nèi)匀豢梢酝ㄟ^(guò)DRFs/NCPKs(死亡調(diào)節(jié)因子/非Caspase 蛋白激酶)和Atgs(自噬相關(guān)蛋白)(Atg2、Atg4、Atg5、Atg7)的功能使細(xì)胞發(fā)生高水平的自噬死亡[3]。家蠶作為全變態(tài)昆蟲(chóng)，在變態(tài)發(fā)育過(guò)程中伴隨著細(xì)胞自噬和凋亡的發(fā)生，本文就家蠶細(xì)胞自噬和凋亡的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為自噬和凋亡在家蠶變態(tài)發(fā)育期的重要作用奠定基礎(chǔ)。

1 家蠶細(xì)胞自噬研究進(jìn)展

家蠶作為鱗翅目的模式昆蟲(chóng)，是進(jìn)行昆蟲(chóng)細(xì)胞自噬和凋亡研究的重要對(duì)象。蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)協(xié)同調(diào)控家蠶的變態(tài)發(fā)育，20E起始家蠶蛻皮，而JH決定蛻皮的本質(zhì)：20E和JH同時(shí)存在時(shí)，發(fā)生幼蟲(chóng)蛻皮；只有20E而沒(méi)有JH時(shí)，發(fā)生變態(tài)蛻皮，而自噬和凋亡是家蠶變態(tài)發(fā)育期兩種重要的生理過(guò)程[4,5]。早期關(guān)于家蠶變態(tài)發(fā)育時(shí)期PCD機(jī)制中自噬和凋亡的研究，主要是描述性的報(bào)道，缺少相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，對(duì)這一過(guò)程中自噬和凋亡的相互關(guān)系比較模糊[6]。Blaes等[7]曾在光學(xué)和電子顯微鏡下觀察饑餓喂養(yǎng)家蠶5齡幼蟲(chóng)期不同階段的絲腺細(xì)胞發(fā)育：輕度饑餓處理后觀察不到絲腺細(xì)胞增大的跡象，認(rèn)為是在饑餓的早期階段導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成和分泌器官細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育受阻，如果在饑餓后2天之內(nèi)開(kāi)始喂食，此種效應(yīng)仍可以逆轉(zhuǎn)；但在重度饑餓后，自噬體和二級(jí)溶酶體會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中迅速形成，細(xì)胞質(zhì)的成分聚集并完全分解而引起蟲(chóng)體死亡。Tojo等[8]在家蠶脂肪體中也得出相同結(jié)論，認(rèn)為饑餓可在幼蟲(chóng)晚期完全阻遏脂肪體中的儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的合成。Goncu和Parlak等[9]的研究證實(shí)：在家蠶的3種核受體復(fù)合物中，EcR-B1活躍參與到絲腺細(xì)胞PCD過(guò)程中，在幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)換蛹之前，自噬體形成時(shí)的細(xì)胞蛋白質(zhì)水平達(dá)到最高。

Zhou等[10]在家蠶中鑒定到2個(gè)Tor旁系同源基因，即BmTor1 (家蠶雷帕霉素靶蛋白1)和BmTor2(家蠶雷帕霉素靶蛋白2)，兩者為一對(duì)反向重復(fù)序列，并且在核酸和氨基酸分析中具有進(jìn)化的結(jié)構(gòu)保守性。他們發(fā)現(xiàn)饑餓或20E誘導(dǎo)家蠶后，BmTor1和BmTor2基因表達(dá)上調(diào)，并且以相似的方式調(diào)節(jié)BmTor的表達(dá)，但BmTor2比BmTor1更敏感。Tian等[11]的研究揭示，在家蠶幼蟲(chóng)蛻皮與幼蟲(chóng)-蛹轉(zhuǎn)變時(shí)的脂肪體細(xì)胞中，20E激素相當(dāng)于閥門(mén)的作用(圖1)：一方面通過(guò)抑制PI3KⅠ/Akt-Tor途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬-打開(kāi)閥門(mén)的作用；另一方面通過(guò)激活20E的早期轉(zhuǎn)錄因子基因BmBr-C、BmE74、BmHR3、Bmβ-ftz-F1，上調(diào)家蠶變態(tài)期脂肪體細(xì)胞中11個(gè)自噬基因(BmATG1、3、4、5、6、7、8、9、12、16、18)的表達(dá)和其細(xì)胞自噬的水平。

圖1 20E信號(hào)通過(guò)2條途徑誘導(dǎo)自噬的模式圖[11]Fig.1 Amodel for the 20E signal to induce autophagy by two indispensible means[11]

到目前為止，無(wú)論是在果蠅或家蠶自噬的前期研究中，都是對(duì)其形態(tài)和分子的基本特征進(jìn)行描述，能觀察到高水平發(fā)生的自噬體、致密小體和線(xiàn)粒體等細(xì)胞器的膨脹，但對(duì)各種自噬體的形態(tài)特征至今未有比較清晰和統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。

2 家蠶細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展

在家蠶脂肪體細(xì)胞中，Tian等[12]通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)證實(shí)凋亡發(fā)生于5齡4天到化蛹期，qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了凋亡途徑中相關(guān)基因Apaf-1,Nedd2like1,Nedd2like2,ICE1,ICE3,ICE5,Arp和IAP的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谟计诟咚奖磉_(dá)，在5齡2天通過(guò)注射外源20E 6 h后，發(fā)現(xiàn)脂肪體細(xì)胞中上述凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，RNA干擾了20E上游調(diào)控元件USP后，凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，說(shuō)明在家蠶變態(tài)發(fā)育過(guò)程中，20E能誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。在家蠶Bm36細(xì)胞中，當(dāng)饑餓處理48 h后發(fā)現(xiàn)Caspase-3-like 和Caspase-9-like活性升高，細(xì)胞經(jīng)過(guò)3-MA處理后自噬明顯被抑制，同時(shí)通過(guò)電鏡觀察到饑餓處理24 h的自噬泡形成[13]。

3 家蠶細(xì)胞自噬和凋亡的相互關(guān)系

圖2 家蠶變態(tài)發(fā)育時(shí)期(L5D5-PD7)幼蟲(chóng)中腸發(fā)生的細(xì)胞自噬先于凋亡[18]Fig.2 Autophagy precedes apoptosis during the remodeling of silkworm larval midgut during metamorphosis(L5D5-PD7)[18]

對(duì)家蠶變態(tài)發(fā)育時(shí)期PCD機(jī)制中的細(xì)胞自噬和凋亡研究，近10年獲得較深入的認(rèn)識(shí)。Zhang等[14]鑒定了家蠶基因組中24個(gè)參與自噬和PI3KⅠ(磷脂酰肌醇-3激酶Ⅰ)和PI3KⅢ(磷脂酰肌醇-3激酶Ⅲ)信號(hào)途徑的基因，這些基因包括11個(gè)BmATGs(家蠶自噬相關(guān)蛋白)基因(BmATG1、3、4、5、6、7、8、9、12、16、18)，分析了其中BmATG8和BmATG12轉(zhuǎn)錄表達(dá)活性。鐘仰進(jìn)等[15]通過(guò)幼蟲(chóng)絲腺在變態(tài)期退化的細(xì)胞學(xué)觀察和凋亡DNA-Ladder檢查，指出化蛹1～3 d絲腺退化消亡的本質(zhì)事件之一是細(xì)胞凋亡。Li等[16-17]進(jìn)一步的研究揭示：在家蠶變態(tài)發(fā)育時(shí)期，幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞中自噬和凋亡的形態(tài)學(xué)特征發(fā)生于化蛹前后，高峰在化蛹初期，凋亡的DNA-Ladder出現(xiàn)于化蛹1～2 d，20E的早晚期轉(zhuǎn)錄因子基因和凋亡的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄峰則在5齡末的游走期和化蛹初；通過(guò)對(duì)自噬基因BmATG5、6、8、12的轉(zhuǎn)錄活性和BmAtg8蛋白質(zhì)表達(dá)分析，表明這4個(gè)自噬基因活性的轉(zhuǎn)錄和BmAtg8的高水平表達(dá)都在游走末期和預(yù)蛹時(shí)期；通過(guò)RNA干擾20E的早晚期轉(zhuǎn)錄因子基因，導(dǎo)致化蛹異?；蛩烙糩17]。他們的研究表明20E信號(hào)關(guān)聯(lián)的自噬和凋亡是化蛹初期絲腺細(xì)胞PCD的主要執(zhí)行者。Franzetti等[18]通過(guò)組織化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)的證據(jù)，揭示了家蠶變態(tài)發(fā)育期幼蟲(chóng)中腸和絲腺細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡的時(shí)序特征，自噬啟動(dòng)于化蛹前的游走期(Wandering stage)，高水平發(fā)生于吐絲期(Spinning stage)，凋亡則滯后啟動(dòng)于化蛹初期，高水平發(fā)生于整個(gè)化蛹時(shí)期，表現(xiàn)為自噬先于凋亡的時(shí)序(圖2)，兩者共同作用導(dǎo)致細(xì)胞不可逆的死亡降解。Xie等[19]通過(guò)生物化學(xué)、分子生物學(xué)等一序列實(shí)驗(yàn)揭示家蠶自噬蛋白BmATG5和BmATG6具有與哺乳動(dòng)物ATG5和Beclin 1相同的分子開(kāi)關(guān)功能，其全長(zhǎng)分子參與20E和饑餓信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，截短型分子BmATG5-tN和BmATG6-C(C1/C2)具有在細(xì)胞自噬中誘導(dǎo)(觸發(fā))細(xì)胞凋亡的功能，是導(dǎo)致昆蟲(chóng)PCD進(jìn)程中細(xì)胞自噬先于凋亡啟動(dòng)的分子機(jī)制(圖3)。

圖3 20E和饑餓在家蠶細(xì)胞誘導(dǎo)自噬和凋亡模式圖[20]Fig.3 A model for 20E and starvation signals to induce autophagy and apoptosis in Bombyx[20]

自噬和凋亡的調(diào)控是十分復(fù)雜的過(guò)程，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中證實(shí)，全長(zhǎng)的Atg4D、Atg5和Beclin-1(酵母Atg6同源物)參與細(xì)胞自噬調(diào)控，而被Caspase-3切割A(yù)tg4D和Beclin-1(酵母Atg6同源物)的截短型片段ΔN63 Atg4D和Beclin-C，被鈣蛋白酶(Calpains)切割A(yù)tg5后的截短型片段tAtg5都能參與細(xì)胞凋亡調(diào)控[20-25]。在家蠶及其它昆蟲(chóng)細(xì)胞中是否存在著自噬相關(guān)蛋白調(diào)控自噬和凋亡的進(jìn)程，有待進(jìn)一步研究[26]。

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