血管緊張素1-7對高脂誘導小鼠肝臟損傷的保護作用*

黃文瀚，任飛鳳，羅 蕾，周 俊，潘珠瑪，郭 暉，唐 琳△（.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院風濕免疫科，重慶40000；.重慶市第七人民醫(yī)院內分泌、腎病科400054；.重慶醫(yī)科大學病毒性肝炎研究所，重慶40006）

高脂血癥是導致肝臟疾病的獨立危險因素[1-2]，脂質沉積與肝臟損傷密切相關[3-4]。人體對于低密度脂蛋白（LDL）的吸收主要受到低密度脂蛋白受體（LDLr）、固醇調節(jié)元件結合蛋白2（SREBP2）和SREBP分解活性蛋白（SCAP）的調控[5]，因此，三者組成負反饋系統(tǒng)，起到調節(jié)體內脂質的作用。

血管緊張素轉化酶2（ACE2）-血管緊張素1-7[Ang-（1-7）]-Mas受體軸是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的一個新的分支，有大量研究報道了該軸參與脂質代謝的調節(jié)[6-7]，但是，其機制目前尚未明確。作者推測，Ang-（1-7）能夠調節(jié)肝臟中LDLr-SREBP2-SREBP分解活性蛋白系統(tǒng)，進而減輕肝臟對脂質的吸收，起到保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康6周齡SPF級C57BL/6小鼠40只，購于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.1.2 動物模型制備 將40只健康C57BL/6小鼠隨機平均分為正常組、高脂組、高脂+Ang-（1-7）組、Ang-（1-7）組。正常組進食普通飼料；高脂組進食高脂飼料（熱量組成：脂肪60%，蛋白質20%，碳水化合物20%）；高脂+Ang-（1-7）組小鼠在高脂飲食的基礎上給予Ang-（1-7），以濃度144 μg/（kg·d）連續(xù)滲透泵（型號2002，Alzet）皮下泵入；Ang-（1-7）組小鼠在給予普通飼料飲食基礎上，以同樣Ang-（1-7）濃度連續(xù)皮下泵入。實驗小鼠按上述實驗方法飼養(yǎng)12周，環(huán)境溫度控制在（20±2）℃，正常光照。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法 所有實驗小鼠于采樣前一晚20：00禁食不禁飲，12 h后采眼眶血，剖取肝臟。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 小鼠血脂水平檢測 采集小鼠眼眶血后以2 000 r/min、離心15 min分離血清，并送檢生化檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、LDL水平。

1.2.2.2 小鼠肝臟油紅O染色 小鼠肝臟行冰凍切片后用10%甲醛鹽溶液固定30 min，用雙蒸水洗2次，向切片加1，2-丙二醇孵育2 min后，加油紅O工作液對切片進行染色30 min，清洗后用Carazzi′s蘇木素對切片染色2 min，清洗后使玻片充分干燥，用甘油乙烯醇（GVA）水溶性封片劑固定，在顯微鏡下對細胞進行觀察并照相保存。

1.2.2.3 小鼠肝臟SREBP2蛋白測定 取小鼠肝臟按試劑盒說明提取總蛋白，并行蛋白濃度測定，等量取各組蛋白30 μg予以上樣、電泳、轉膜、封閉后，分別加SREBP2和磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）一抗孵育過夜，Tris堿吐溫緩沖液沖洗后放入羊抗兔二抗中孵育1 h。洗膜后行電化學發(fā)光曝光采集圖像，分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，試驗結果采用單因素方差分析（one-wayANOVA），多重檢驗校正采用Bonferroni校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠血清血脂水平檢測結果 高脂組小鼠血清TC、TG、LDL水平均明顯高于正常組和高脂+Ang-（1-7）組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Ang-（1-7）組單獨處理C57BL/6小鼠，其血清TC、TG、LDL水平與正常組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠血清血脂水平檢測結果比較（±s，mmol/L）

表1 各組小鼠血清血脂水平檢測結果比較（±s，mmol/L）

注：與高脂組比較，aP＜0.05

指標TC TG LDL正常組2.31±0.28a 0.44±0.04a 0.28±0.03a高脂組4.17±0.34 0.78±0.09 0.61±0.07高脂+Ang-（1-7）組3.11±0.21a 0.61±0.11a 0.47±0.05a Ang-（1-7）組2.26±0.32 0.47±0.06 0.31±0.05

2.2 小鼠肝臟組織油紅O染色結果 正常組小鼠肝臟中脂質分布均勻（圖1A）；而高脂組小鼠肝臟組織中可見大量紅染脂質沉積（圖1B）；Ang-（1-7）能顯著抑制小鼠肝臟對脂質的吸收（圖 1C）。Ang-（1-7）單獨處理C57BL/6小鼠，其肝臟脂質分布與正常組無差異（圖1D）。

圖1 C57BL/6小鼠肝臟組織油紅O染色（200×）

2.3 小鼠肝臟SREBP2蛋白表達水平 Western blotting檢測結果顯示，高脂組小鼠肝臟中SREBP2蛋白表達水平較正常組降低，高脂+Ang-（1-7）組小鼠肝臟中SREBP2蛋白表達水平較高脂組更為抑制，而Ang-（1-7）組小鼠肝臟中SREBP2蛋白表達水平與正常組無明顯差異。見圖2。

圖2 C57BL/6小鼠肝臟SREBP2蛋白表達水平

3 討 論

ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的發(fā)現(xiàn)使得該軸成為一項新的研究熱點。SANTOS等[8]發(fā)現(xiàn)，在高脂誘導的大鼠模型中，Ang-（1-7）能夠明顯減輕大鼠的體重和皮下脂肪的含量，并且降低血漿TC和TG水平。此外，SINGH等[9]研究小組報道，在糖尿病大鼠研究模型中，Ang-（1-7）能夠顯著緩解大鼠血脂異常，進一步證實Ang-（1-7）對血脂的調節(jié)作用。

然而，ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的脂質調節(jié)機制仍然不清。OH 等[10]認為，Ang-（1-7）在大鼠體內通過增加甘油的釋放起到分解脂肪的作用，而這一作用能夠被磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制劑削弱，提示Ang-（1-7）是通過PI3K信號通路發(fā)揮作用。SANTOS等[11]則認為，脂肪脂質結合蛋白參與了脂肪酸的酯化過程，而Ang-（1-7）可增加體內該蛋白的表達，從而起到調節(jié)脂質代謝的作用。

本動物研究結果表明了另一種脂質調節(jié)過程，發(fā)現(xiàn)在高脂飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠中，Ang-（1-7）能夠顯著降低小鼠血清TC、TG、LDL水平，抑制肝臟對脂質的吸收，并且證實ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸參與脂質代謝調控是通過調節(jié)C57BL/6小鼠肝臟中LDLr-SREBP2-SCAP負反饋軸而實現(xiàn)。首先，本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可引起小鼠肝臟LDLr-SREBP2-SCAP軸正常的負反饋效應，使 SREBP2 蛋白的表達降低；其次，Ang-（1-7）在小鼠皮下微量泵入能夠使這一負反饋效應放大，導致小鼠肝臟SREBP2蛋白表達進一步下降，而SREBP2的低表達可抑制LDLr基因轉錄，因此，LDLr的合成相應減少，從而阻止C57BL/6小鼠肝臟細胞對脂質的吸收，起到對肝臟的保護作用。

本研究進一步從機制層面闡明了ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸對脂質代謝的調節(jié)，豐富了對Ang-（1-7）的認識，同時也為后續(xù)的研究打下了理論基礎。

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