內(nèi)皮抑素聯(lián)合重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子對兔耳增生性瘢痕的實驗研究*

吳 萍，熊愛兵

增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS)常表現(xiàn)為表面顏色鮮紅，局部增厚變硬，過度生長，凸出于正常皮膚表面。尤其是燒燙傷創(chuàng)面，瘢痕增生嚴(yán)重，不僅影響美觀，關(guān)節(jié)處或某些器官瘢痕攣縮甚至嚴(yán)重影響患者日常生活，造成一定的心理和社會危害。增生性瘢痕形成的機(jī)制仍有待研究。通過對正常皮膚組織與增生性瘢痕組織的研究對比發(fā)現(xiàn)，后者毛細(xì)血管密度更高[1]。內(nèi)皮抑素是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑，能通過抑制微血管生成從而抑制瘢痕增生。重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（rbFGF）是一種多功能細(xì)胞生長因子，大量研究表明其具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。該實驗擬建立兔耳瘢痕模型，研究內(nèi)皮抑素聯(lián)合外用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子對增生性瘢痕的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

健康成年新西蘭大耳兔12只，購自西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，雌雄不拘，體重2.0～2.5 kg；重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（rbFGF，商品名貝復(fù)濟(jì)），珠海億勝生物制藥廠生產(chǎn)；重組人血管內(nèi)皮抑制素（商品名恩度），山東先聲麥得津生物制藥有限公司生產(chǎn)；DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；鼠抗兔CD34抗體、兔抗兔GAPDH抗體，abcam生產(chǎn)；兔抗兔bFGF抗體，bioss公司生產(chǎn)；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒，ASPEN公司生產(chǎn)；鼠抗兔Bcl-2抗體，博士德公司生產(chǎn)。

1.2 模型制作及分組

以Morris方法為參考建模:用1%戊巴比妥鈉1mL/kg做耳緣靜脈麻醉后，固定滿意，消毒，鋪巾。用自制打孔器在兔耳腹側(cè)作直徑為1.0 cm×1.0 cm創(chuàng)面，去除兔耳全層皮膚并刮除軟骨膜，每只兔耳作6個相同創(chuàng)面，每個間隔0.5 cm，共計144個創(chuàng)面，術(shù)后創(chuàng)面暴露。術(shù)后一周再創(chuàng)傷，除去痂殼形成二次創(chuàng)面。待創(chuàng)面自行愈合，一般需15～20 d。實驗為4組，每組3只。A組（貝復(fù)濟(jì)組）、B組（內(nèi)皮抑素組）、C組(貝復(fù)濟(jì)+內(nèi)皮抑素組)、D組（生理鹽水組）。分組處理如下:A組、C組創(chuàng)面形成當(dāng)日即開始噴灑貝復(fù)濟(jì)至創(chuàng)面痊愈，實驗B組、C組于術(shù)后第21 d開始腹腔注射內(nèi)皮抑素，劑量為1.5 mg/5 mL，D組注射等量生理鹽水。每天1次連續(xù)注射一周。

1.3 取材

藥物注射后第14 d，切取各組瘢痕組織。將所取組織從頂部均分為兩份，一半作HE染色，另一半作分子生物學(xué)檢測。

1.4 觀察和檢測

1.4.1 大體觀察

各組每日觀察并記錄創(chuàng)面術(shù)后傷口愈合、上皮化時間及瘢痕生長過程；并記錄創(chuàng)面滲出、色澤、質(zhì)地、大小變化情況及術(shù)后瘢痕增生情況。觀察藥物注射當(dāng)天和注射后第7、10、13 d瘢痕顏色、硬度。

1.4.2 HE染色

組織學(xué)標(biāo)本用甲醛（體積分?jǐn)?shù)為10%）固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木素伊紅染色(HE)，行光鏡觀察成纖維細(xì)胞及膠原纖維。

1.4.3 免疫組織化學(xué)檢測CD34、bFGF

采用SP免疫組織化學(xué)法，按試劑盒說明書操作。其中一抗為兔抗兔bFGF多克隆抗體、鼠抗兔CD34多克隆抗體，稀釋濃度均為1∶100，二抗為HRP標(biāo)記山羊抗兔、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠等，稀釋濃度為1∶200。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡下觀察并攝片。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析陽性染色的平均光密度值。

①通過檢測微血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD34表達(dá)，間接反映增生性瘢痕組織中的微血管密度，計算CD34陽性細(xì)胞百分比，每片組織取5個高倍鏡（×400）視野，以視野中陽性細(xì)胞所占比例的均值表示。②bFGF表達(dá)檢測結(jié)果判定:每張切片隨機(jī)采集5個高倍鏡(×400)視野（棕黃色顆粒狀著色為陽性表達(dá)），以視野中陽性細(xì)胞所占比例的均值表示。

1.4.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測Bcl-2蛋白分子表達(dá)情況

成功提取胞漿胞核蛋白后，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度，保證每個樣品總蛋白上樣量均為40 μg，依次進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育，滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)?，曝光，根?jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件，顯影、定影。將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，統(tǒng)計方法采用方差分析（F檢驗），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察結(jié)果

造模后第21 d，各組均可見明顯增生性瘢痕，色暗紅，觸之較硬，表明兔耳瘢痕模型建造成功。傷后第42 d，肉眼見各組均形成錐形瘢痕，生理鹽水組瘢痕增生最明顯，顏色暗紅，充血明顯；內(nèi)皮抑素組和內(nèi)皮抑素聯(lián)合貝復(fù)濟(jì)組肉眼未見明顯差異，與生理鹽水組對比，瘢痕增生高度較小，呈輕度增生隆起，色呈淡紅色。

2.2 病理切片HE染色觀察

生理鹽水組見明顯粗大紊亂纖維，部分纖維斷裂。與生理鹽水對照組相比，貝復(fù)濟(jì)組、內(nèi)皮抑素組及內(nèi)皮抑素與貝復(fù)濟(jì)聯(lián)合應(yīng)用組排列相對整齊，纖維結(jié)構(gòu)更為纖細(xì)。其中，內(nèi)皮抑素與貝復(fù)濟(jì)聯(lián)合應(yīng)用組排列最整齊（圖1）。

圖1 四組切片HE染色結(jié)果（×400）

2.3 CD34及bFGF免疫組化結(jié)果

免疫組織化學(xué)CD34染色結(jié)果顯示:A組(22.84± 0.3)%，B組（12.7± 0.53）%，C組（5.93± 0.57）%，D組（41.96±03.82）%，C組分別與A組、B組、D組比較，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1、圖2、圖4）

免疫組化bFGF染色結(jié)果：A組（133765.37±5316.70）%，B組（296209.91±22961.17）%，C組（552960.53±56787.72)%，D組（58571.32±2414.95）%，C組分別與A組、B組、D組比較，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。（表1、圖3、圖4）

表1 各組CD34、bFGF陽性率比較（n=36，x±s）

圖2 四組切片CD34免疫組化染色結(jié)果（SP法，×400）

圖3 四組切片bFGF免疫組化染色結(jié)果（SP法，×400）

圖4 各組瘢痕組織免疫組化染色結(jié)果比較

2.4 Bcl-2檢測結(jié)果

A組(0.341±0.029)%，B組(0.201±0.015)%，C組(0.076±0.015)%，D組（0.539±0.063)%，C組分別與A組、B組、D組比較，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)（表2、圖5）。

表2 各組Bcl-2陽性率比較（n=36，x±s）

圖5 四組Bcl-2蛋白免疫印跡檢測結(jié)果

3 討 論

增生性瘢痕形成機(jī)制十分復(fù)雜，多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和生長因子等參與了這個過程。內(nèi)皮抑素是抑制血管生長最重要的因子，大量研究表明，內(nèi)皮抑素除能抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶等，從而減輕血管增生。王西樵等[2]通過研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮抑素通過抑制瘢痕血管生成，減少瘢痕營養(yǎng)及氧供的同時，也破壞了成纖維細(xì)胞周圍微環(huán)境而致使其功能減退和凋亡，從而減輕兔耳瘢痕形成并促進(jìn)瘢痕消退及成熟。因此，抑制瘢痕血管生成即可減輕瘢痕增生。近期有研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，預(yù)防血管過度增生是防治瘢痕的關(guān)鍵及有效方法，增生性瘢痕的消退與內(nèi)皮功能障礙有密切關(guān)系。有研究表明內(nèi)皮抑素抑制瘢痕增生主要是通過抑制增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞增殖[5]。本實驗組織學(xué)結(jié)果顯示，內(nèi)皮抑素組與生理鹽水對照組相比，應(yīng)用內(nèi)皮抑素組纖維排列較整齊，微血管密度明顯降低，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明內(nèi)皮抑素抑制瘢痕組織中血管增生從而減輕瘢痕。

bFGF是最有效的血管促進(jìn)因子之一，具有促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)和組織再生的作用。雖然貝復(fù)濟(jì)（rbFGF）已廣泛應(yīng)用于臨床，但bFGF是否會導(dǎo)致瘢痕增生也眾說紛紜。程彪等[6]證明外用bFGF可以增加創(chuàng)面TGF-β1，促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，加快創(chuàng)面愈合，同時級聯(lián)其他生長因子及細(xì)胞因子通路，加速修復(fù)細(xì)胞的凋亡。徐祥[7]發(fā)現(xiàn)bFGF與眾多血管促進(jìn)因子具有協(xié)同作用，外用bFGF能夠使VEGF等因子表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)微血管生成，加速創(chuàng)面愈合。在促血管生成過程中，bFGF與VEGF二者相輔相成，必須同時存在才能達(dá)到促血管效果。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，bFGF能促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生無瘢痕修復(fù)[8]。本研究組織學(xué)結(jié)果顯示，應(yīng)用貝復(fù)濟(jì)后微血管數(shù)明顯降低，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；可以認(rèn)為外用貝復(fù)濟(jì)能減輕血管形成，減輕增生性瘢痕形成。

當(dāng)內(nèi)皮抑素促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的同時，血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子等也會減少。有研究者發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素通過下調(diào)VEGF和TIMP-1減輕兔耳增生性瘢痕形成[9]。bFGF可使內(nèi)皮細(xì)胞中的存活素(Sur?vivin）表達(dá)上調(diào)，而存活素可能通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)新生血管生成，為成纖維細(xì)胞的增生提供過量的氧氣和養(yǎng)料促進(jìn)瘢痕增生。樊丁才[10]發(fā)現(xiàn)bF?GF可增加MMP-1含量，降解膠原蛋白，減輕細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而抑制瘢痕增生。貝復(fù)濟(jì)在創(chuàng)面愈合早期使用意義更大。本實驗早期外用貝復(fù)濟(jì)，創(chuàng)面上皮化后應(yīng)用內(nèi)皮抑素，結(jié)果表明組織中bFGF量增加，其中貝復(fù)濟(jì)聯(lián)合內(nèi)皮抑素組升高最明顯，推測其可能原因為貝復(fù)濟(jì)早期促進(jìn)創(chuàng)面形成較多血管，但隨創(chuàng)面愈合，成纖維細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞減少，應(yīng)用內(nèi)皮抑素后，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。有學(xué)者證實血管內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌細(xì)胞因子的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于成纖維細(xì)胞的自分泌[11]。通過各因子間級聯(lián)反應(yīng)，影響其與相應(yīng)受體結(jié)合，從而形成較高濃度bFGF的微環(huán)境。張曉明等[12]研究證實應(yīng)用內(nèi)皮抑素后，瘢痕組織中bFGF表達(dá)上調(diào)，但VEGF表達(dá)降低，因此不會促進(jìn)瘢痕增生。

Bcl-2是抑凋亡基因，與細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系，當(dāng)其表達(dá)降低時細(xì)胞凋亡加快。任海濤[13]通過腹腔注射內(nèi)皮抑素發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素可以下調(diào)Bcl-2，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制血管形成，使內(nèi)皮細(xì)胞釋放促纖維化的細(xì)胞因子減少。程彪等[6]人證明外用貝復(fù)濟(jì)能加速修復(fù)細(xì)胞凋亡。本實驗進(jìn)一步證實內(nèi)皮抑素下調(diào)Bcl-2，同時貝復(fù)濟(jì)組與生理鹽水對照組相比、內(nèi)皮抑素組與內(nèi)皮抑素聯(lián)合貝復(fù)濟(jì)組相比較，表明外用貝復(fù)濟(jì)也可下調(diào)Bcl-2，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，且兩藥聯(lián)用后有協(xié)同作用。

4 結(jié) 論

外用貝復(fù)濟(jì)聯(lián)合腹腔注射內(nèi)皮抑素可以減輕增生性瘢痕的形成，表明內(nèi)皮抑素與貝復(fù)濟(jì)聯(lián)用不僅不會削弱兩藥藥效，反而可產(chǎn)生協(xié)同作用。且本實驗表明，應(yīng)用貝復(fù)濟(jì)和內(nèi)皮抑素后，瘢痕中微血管數(shù)明顯降低，其機(jī)制可能是內(nèi)皮抑素與貝復(fù)濟(jì)共同下調(diào)Bcl-2，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減少增生性瘢痕的血液供應(yīng)，從而減輕瘢痕。本實驗為兩藥聯(lián)用治療創(chuàng)面增生性瘢痕提供了一定的理論依據(jù)。近來已有研究者[14]將內(nèi)皮抑素應(yīng)用于臨床改善瘢痕及預(yù)后，且該方法被證實有效，期待有更多相關(guān)研究及后續(xù)報道。

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