基因生物信息學(xué)的膿毒癥潛在發(fā)病機(jī)制研究及生物標(biāo)記物篩選*

王海清，左 文，陳睦虎，胡迎春，楊蕊萍，鐘 武

膿毒癥是指機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[1]。病情危重時(shí)可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（MODS）和（或）循環(huán)衰竭，是臨床上常見(jiàn)的一種急危重癥[2～5]。每年全球有超過(guò)180萬(wàn)重癥膿毒癥的病例，其發(fā)病速度快，臨床病死率高，若合并感染性休克，病死率約80%[6]。目前認(rèn)為，微循環(huán)障礙是發(fā)生MODS甚至死亡的主要因素，其中內(nèi)皮細(xì)胞以及相關(guān)促凝效應(yīng)等起決定性作用，但其具體分子機(jī)制仍不明確。因膿毒癥是機(jī)體應(yīng)對(duì)感染所發(fā)生的一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng)，早期主要表現(xiàn)為強(qiáng)力抗感染，晚期主要表現(xiàn)為劇烈而持久的免疫抑制反應(yīng)，這表明多種生物標(biāo)記物或許可以用來(lái)早期識(shí)別膿毒癥[7]。而膿毒癥治療效果差的根本原因在于目前膿毒癥發(fā)病機(jī)制尚不清楚，用于膿毒癥臨床診斷及判斷療效的指標(biāo)欠缺，尤其需要獲取其早期診斷指標(biāo)和治療作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，找出的差異基因成千上萬(wàn)，如何在眾多差異基因中篩選出對(duì)疾病起關(guān)鍵作用的基因已成為技術(shù)瓶頸，生物信息學(xué)技術(shù)在此基礎(chǔ)上應(yīng)運(yùn)而生，可以幫助研究者快速找到核心基因群。

本文擬基于GEO基因表達(dá)數(shù)據(jù)，全面分析膿毒癥疾病狀態(tài)，從而構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)，并篩選潛在的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，這些分子靶點(diǎn)可能為我們尋找膿毒癥發(fā)病機(jī)理提供新的見(jiàn)解，或許可以用于早期診斷膿毒癥并為臨床治療膿毒癥提供新思路。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)隸屬于美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI），是目前全球最大、最完整的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)資源[8]。基因表達(dá)譜GSE28750下載于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，種屬為人類，芯片平臺(tái)GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Ge?nome U133 Plus 2.0 Array。該芯片數(shù)據(jù)包括10例膿毒癥患者及19例健康人的基因表達(dá)陣列數(shù)據(jù)[9]。

1.2 差異表達(dá)基因處理

GCBI（Gene-Cloud of Biotechnology Information，網(wǎng)址：https://www.gcbi.com.cn）是我國(guó)研發(fā)的基于R語(yǔ)言的在線分析軟件，能便捷的對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)處理。通過(guò)GCBI軟件，對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)先進(jìn)行對(duì)數(shù)化標(biāo)準(zhǔn)處理以利于分析，再篩選差異表達(dá)基因，篩選條件為：①P＜0．01；②差異倍數(shù)≥2。

1.3 基因本體論分析

基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)從功能、參與的生物途徑及細(xì)胞中的定位三個(gè)方面對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化描述（即對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行了簡(jiǎn)單注釋）。通過(guò)GO富集分析可以大致明了差異表達(dá)基因在哪些生物學(xué)功能、途徑或者細(xì)胞定位方面進(jìn)行富集[10]。通過(guò)GC?BI平臺(tái)對(duì)上傳的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，選擇差異最顯著的10個(gè)功能進(jìn)行排序并分析。

1.4 pathway分析

KEGG（京都基因與基因組百科全書(shū)，網(wǎng)址：http://www.genome.jp/kegg/）是日本京都大學(xué)生物信息學(xué)中心的Kanehisa實(shí)驗(yàn)室建立的以基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息為基礎(chǔ)、全面展示生物及細(xì)胞所包括的生物學(xué)信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，它可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)在各種細(xì)胞活動(dòng)中所起作用并將其繪制成網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，可以了解疾病狀態(tài)下顯著改變的代謝通路，這對(duì)于實(shí)驗(yàn)機(jī)制的探索意義重大?；贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因信號(hào)通路富集分析，選擇差異最顯著的10個(gè)功能進(jìn)行排序并分析。

1.5 信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析

基因信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析是基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白和蛋白之間的相互作用關(guān)系而構(gòu)建的基因間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。它解構(gòu)了KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，克服了KEGG-Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)中基因間相互作用關(guān)系受限于某一Pathway的局限，因而，基因信號(hào)網(wǎng)絡(luò)是在整個(gè)KEGG-Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選某個(gè)蛋白的上游及下游蛋白。對(duì)差異表達(dá)基因使用基于KEGG的GC?BI平臺(tái)進(jìn)行基因信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析，并繪制成網(wǎng)絡(luò)，以便了解差異基因之間的相互調(diào)控關(guān)系。

1.6 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析通過(guò)基因表達(dá)的相似性簡(jiǎn)單直觀的分析基因產(chǎn)物可能存在的相互作用關(guān)系，從而更深入的發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵調(diào)控基因及其相互作用脈絡(luò)。對(duì)差異表達(dá)基因使用GCBI平臺(tái)進(jìn)行共表達(dá)分析，并繪制成網(wǎng)絡(luò)，推測(cè)其潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

對(duì)數(shù)化標(biāo)準(zhǔn)處理前后的膿毒癥組和健康對(duì)照組基因芯片數(shù)據(jù)結(jié)果（見(jiàn)圖1～2），可知本研究標(biāo)本經(jīng)對(duì)數(shù)化處理后數(shù)據(jù)均一性較好，兩組之間具有可比性。

圖1 樣本芯片數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)化標(biāo)準(zhǔn)處理前

2.2 差異基因篩選結(jié)果

通過(guò)對(duì)兩組數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，共獲得2 457個(gè)差異表達(dá)基因，與對(duì)照組相比，膿毒癥組上調(diào)基因1 282個(gè)、下調(diào)基因1 175個(gè)(見(jiàn)圖3)。由圖可知，我們篩選的差異基因能較好的區(qū)分出2個(gè)組。

圖3 差異表達(dá)基因聚類圖

2.3 差異表達(dá)基因GO分析結(jié)果

采用GCBI平臺(tái)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，其中最顯著的10功能依次為：T細(xì)胞共刺激、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、免疫反應(yīng)、翻譯、固有免疫反應(yīng)、血液凝固、基因表達(dá)、小分子物質(zhì)代謝過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（見(jiàn)圖4）。

圖2 樣本芯片數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)化標(biāo)準(zhǔn)處理后

圖4 差異表達(dá)基因G0分析結(jié)果圖

2.4 差異表達(dá)基因pathway分析結(jié)果

表1列出了15個(gè)差異最顯著的富集通路，其主要涉及凋亡、細(xì)胞周期、免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

2.5 差異表達(dá)基因信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

圖5顯示了前20個(gè)網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)基因。由圖可知，GNAI3、PIK3CB、MAPK14、IL8為其關(guān)鍵基因。

2.6 差異表達(dá)基因共表達(dá)分析

使用GCBI對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行共表達(dá)分析，其中前216個(gè)節(jié)點(diǎn)共表達(dá)圖見(jiàn)圖6，由圖可發(fā)現(xiàn)，上調(diào)和下調(diào)基因分別呈聚集性分部，符合共表達(dá)理論。其中前15個(gè)節(jié)點(diǎn)名稱、功能見(jiàn)表2。

3 討 論

膿毒癥是臨床常見(jiàn)且死亡率極高的急危重癥，是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，在此過(guò)程中，病原微生物作為始發(fā)因素，其后多種促炎細(xì)胞因子、抗炎細(xì)胞因子、炎性細(xì)胞、信號(hào)通路等共同參與其中[9]。已有研究者報(bào)道膿毒癥的發(fā)生機(jī)制，但很少涉及其分子標(biāo)記物，事實(shí)上，分子生物標(biāo)記物對(duì)于膿毒癥的診斷、監(jiān)測(cè)及預(yù)后具有很大的潛力[11]。

表1 差異表達(dá)基因pathway分析

圖5 差異表達(dá)基因信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析

圖6 差異表達(dá)基因前216個(gè)節(jié)點(diǎn)共表達(dá)圖

表2 差異表達(dá)基因共表達(dá)顯著差異前15個(gè)節(jié)點(diǎn)

本研究中通過(guò)使用微陣列的方法對(duì)膿毒癥組及健康對(duì)照組基因芯片進(jìn)行分析比較，共篩選出2 457個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1 282個(gè)，主要涉及細(xì)胞膜穩(wěn)定性、基因轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程、物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)等方面；下調(diào)基因1 175個(gè)，主要涉及免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等過(guò)程。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，二者差異最顯著的功能主要涉及固有免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)代謝、基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯等方面。通過(guò)對(duì)二者進(jìn)行pathway分析發(fā)現(xiàn)，其差異最顯著富集通路仍主要涉及物質(zhì)代謝、基因表達(dá)、免疫反應(yīng)等方面。將基因間相互作用形成網(wǎng)絡(luò)后可見(jiàn)膿毒癥組及健康對(duì)照組之間差異也主要集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)代謝、免疫反應(yīng)、基因表達(dá)等方面，其中MAPK signaling pathway在網(wǎng)絡(luò)圖中有38個(gè)上游信號(hào)通路、5個(gè)下游信號(hào)通路，Apoptosis有27個(gè)上游信號(hào)通路、3個(gè)下游信號(hào)通路，以此推測(cè)膿毒癥患者死亡率高可能和免疫細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)異常有關(guān)。

其次，通過(guò)対差異表達(dá)基因進(jìn)行了基因信號(hào)間相互作用分析，分析發(fā)現(xiàn)：GNAI3上游有11個(gè)基因與其聯(lián)系，下游有9個(gè)基因與其聯(lián)系，GNAI3功能主要涉及細(xì)胞周期、血液凝固、突觸傳遞、細(xì)胞分裂等[12]，推測(cè)其為膿毒癥發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵基因；PIK3CB上游有24個(gè)基因與其聯(lián)系，下游有6個(gè)基因與其聯(lián)系，其功能主要涉及內(nèi)皮細(xì)胞增殖、自噬的正調(diào)節(jié)、血液凝固、適應(yīng)性免疫應(yīng)答等[13-15]，推測(cè)PIK3CB為膿毒癥發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵基因；MAPK14上游有15個(gè)基因與其聯(lián)系，下游有8個(gè)基因與其聯(lián)系，主要對(duì)炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)、在DNA損傷反應(yīng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等[16]，也可能為膿毒癥發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵基因；IL8上下游分別有4個(gè)及5個(gè)基因與其聯(lián)系，其功能主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗感染、中性粒細(xì)胞的活化等[17]，推測(cè)此基因也可能為膿毒癥發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵基因。

對(duì)差異表達(dá)基因的共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)GYG1、SERPINB1、SAMSN1、ATP11B 這四個(gè)基因分別有39、39、33、33個(gè)基因與其他基因表達(dá)呈相同趨勢(shì)，這些基因的作用主要體現(xiàn)在物質(zhì)代謝、免疫反應(yīng)、細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面[18-20]，或許為膿毒癥的關(guān)鍵基因。

目前，生物信息學(xué)已被廣泛應(yīng)用于建立各種生物數(shù)據(jù)庫(kù)并對(duì)其進(jìn)行管理、研發(fā)數(shù)據(jù)庫(kù)接口及檢索工具、從海量數(shù)據(jù)中提取新知識(shí)等方面，更重要的是，生物信息學(xué)還可以研究基因表達(dá)過(guò)程中的聚群關(guān)系，并從中提取其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及代謝途徑方面的信息，進(jìn)而從整體水平模擬細(xì)胞內(nèi)的全部相關(guān)的生化反應(yīng)，從而在亞細(xì)胞水平闡釋生命活動(dòng)。GCBI是我國(guó)研發(fā)的一款發(fā)掘生物信息學(xué)信息的軟件。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)GCBI使用基因信號(hào)間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析聯(lián)合共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析的方法篩選膿毒癥關(guān)鍵基因，既克服了基因信號(hào)間相互作用分析缺乏創(chuàng)新性和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析可靠性欠佳的缺點(diǎn)，又保留了基因信號(hào)間相互作用分析結(jié)果真實(shí)可靠和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析創(chuàng)新性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，二者相互結(jié)合能夠更好的篩選出受實(shí)驗(yàn)因素影響較大的核心基因。但生物信息學(xué)仍然需要分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證其準(zhǔn)確性以及后續(xù)基因、蛋白功能，生物信息學(xué)分析加進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證必將成為以后科研流行趨勢(shì)。

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