膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞株的建立及其殺傷功能的檢測*

李 根，尹甲偉，王麗娟，車峰遠,4，衡雪源

膠質瘤是發(fā)病率最高的原發(fā)性顱內腫瘤[1]。膠質瘤的病理分類十分復雜，分為星形細胞瘤、髓母細胞瘤、多形膠母細胞瘤、室管膜瘤、少枝膠母細胞瘤等。WHO分類將膠質瘤分為I～IV四個級別[2]。近年來，盡管手術切除、放療及化療等治療手段取得了一定的效果，膠質瘤的生長依然活躍，治療效果仍然較差。因手術難以完全根除腫瘤床周邊的腫瘤組織，術后腫瘤容易在原腫瘤周圍組織復發(fā)，且對放療及化療也不敏感[3-4]。高級別（III～IV級）膠質瘤預后很差，患者生存期短，死亡率較高[2,5]。所以，迫切需要研究新的治療方法，提高膠質瘤的治療療效，控制腫瘤的生長，延長患者的生存期。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織內存在一類細胞，這類細胞具有無限增殖、自我更新及多向分化等能力，稱為腫瘤干細胞[6]。腫瘤干細胞對常規(guī)放療和化療不敏感。據報道，膠質瘤內也存在這類腫瘤干細胞[7]。膠質瘤腫瘤干細胞通常表達CD133分子[8]。而且，膠質瘤腫瘤干細胞在膠質瘤發(fā)生發(fā)展、化療耐藥、侵襲及轉移過程中發(fā)揮重要作用[9]。因此，消滅膠質瘤腫瘤干細胞是治療膠質瘤的關鍵。

近年來，腫瘤免疫治療已成為研究的熱點。人們對于膠質瘤免疫治療的關注也日益增多。腫瘤免疫治療結合其他治療策略可能為膠質瘤患者帶來新的希望。目前，已有臨床試驗研究證實，抗腫瘤特異性抗原的活性疫苗能有效地治療膠質瘤[10-11]。本研究建立了膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞株，并對其殺傷功能進行檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人膠質瘤細胞株U251及SF295分別購自中國科學院細胞庫和凱基生物。DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司（Hyclone,Los Angeles,CA,USA），T細胞培養(yǎng)基、胰酶消化液、L-谷氨酰胺、B27（50×）、青霉素-鏈霉素雙抗及胎牛血清購自Gibco公司（Gibco,Grand Island,NY,USA），膠原酶D購自Roche公司（Roche,Basel,Switzerland），表皮生長因子、成纖維細胞生長因子及白血病抑制因子購自Pe?proTech公 司（PeproTech,USA），CD3及 CD133 MACS kit購自Miltenyi Biotec公司（Miltenyi Biotec,Teterow，Germany），IL-2、IL-7及IL-15購自R&D公司（R&D,MA,USA），同型對照（isotype control）、CD133、CD107a、IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素流式抗體購自eBioscience公司（eBioscience,San Diego,USA）。

1.2 方法

1.2.1 膠質瘤腫瘤干細胞的誘導及CD133+膠質瘤腫瘤干細胞的獲得

取對數(shù)生長期膠質瘤細胞株，胰酶消化成單細胞，用無血清培養(yǎng)基（含DMEM/F12、B27 1×、表皮生長因子20 ng/mL、成纖維細胞生長因子20 ng/mL，白血病抑制因子10 ng/mL、L-谷氨酰胺1×）培養(yǎng)。每隔3～4 d更換一次新鮮無血清培養(yǎng)基，約1周后可見細胞成球生長，獲得足夠數(shù)量膠質瘤腫瘤干細胞球，通過磁珠分選方法，分離并獲得膠質瘤CD133+腫瘤干細胞。

1.2.2 建立膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞株

從健康供者外周血中分離獲得單個核細胞，磁珠分選獲得CD3+T細胞。輻照過的膠質瘤CD133+腫瘤干細胞誘導并與CD3+T細胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d為一個周期。共培養(yǎng)7 d后，收集T細胞，繼續(xù)加入輻照過的膠質瘤CD133+腫瘤干細胞誘導T細胞，共培養(yǎng)體系中加入IL-2(10 IU/mL)、IL-7(5 ng/mL)和IL-15(5 ng/mL)。反復誘導和共培養(yǎng)T細胞四個周期，建立膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞株。

1.2.3 流式細胞學檢測

流式細胞學檢測細胞表面蛋白的表達：收集細胞，PBS洗滌并重懸細胞，加入流式抗體，避光孵育30 min，洗滌細胞，使用流式細胞儀(FACS Canto;BD Biosciences)檢測，使用Flow Jo軟件分析結果。檢測細胞內蛋白表達時，首先對細胞進行穿膜，其余操作步驟同表面蛋白檢測。

2 結 果

2.1 膠質瘤腫瘤干細胞表達CD133

首先，使用人膠質瘤細胞株SF 295誘導生成膠質瘤腫瘤干細胞。其次，通過流式細胞學，檢測膠質瘤腫瘤干細胞CD133分子的表達水平。如圖1所示，膠質瘤腫瘤干細胞表達CD133。

圖1 流式細胞學檢測膠質瘤腫瘤干細胞CD133的表達

2.2 膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞表達IFN-及CD107a

IFN-及CD107a常用作細胞毒性T淋巴細胞發(fā)揮殺傷作用的標記。我們使用膠質瘤CD133+腫瘤干細胞作為靶細胞，誘導刺激并建立膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞株。使用膠質瘤CD133+腫瘤干細胞重復刺激膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞后，流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)，如圖2所示，膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞分泌IFN-及CD107a。因此，膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞對膠質瘤CD133+腫瘤干細胞具有細胞毒性殺傷作用。

圖2 流式細胞學檢測膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞IFN-及CD107a的表達

2.3 膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞表達穿孔素及顆粒酶B

細胞毒性T淋巴細胞發(fā)揮殺傷功能的主要機制有：通過釋放穿孔素和顆粒酶及通過Fas/FasL通路誘導的凋亡。膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞通過流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)，如圖3所示，膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞表達穿孔素和顆粒酶B。因此，膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞通過穿孔素/顆粒酶通路殺傷膠質瘤CD133+腫瘤干細胞。

圖3 流式細胞學檢測膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞穿孔素及顆粒酶B的表達

3 討論

免疫系統(tǒng)的作用是識別危險，維持機體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保護宿主免受感染及惡性腫瘤等的攻擊。腫瘤未經治療時，處于發(fā)展及持續(xù)進展狀態(tài)，這主要是因為缺乏免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。腫瘤免疫療法的目的是利用免疫系統(tǒng)的固有能力來識別和殺死惡性腫瘤細胞，與傳統(tǒng)化療相比，腫瘤免疫治療特異性強，毒副反應小[12]。傳統(tǒng)觀念認為，由于血腦屏障的存在，大腦是一個免疫豁免的區(qū)域[13-14]。目前，越來越多的研究認為，大腦內存在免疫應答反應。大腦組織或器官內的一些細胞作為抗原提呈細胞，參與機體的免疫應答反應，這為膠質瘤的免疫治療提供了基礎[15-16]。膠質瘤免疫治療主要是使用腫瘤細胞或其組成成分合成疫苗和具有合成肽段的疫苗[17]。許多隨機、對照臨床試驗的結果顯示疫苗治療效果較好，但還不能提高患者的生存率[12]。惡性膠質瘤免疫治療的主要障礙是腫瘤導致的免疫抑制。腫瘤免疫抑制的機制涉及多種因素包括調節(jié)性T細胞，腫瘤PD-L1的表達，和CTLA-4信號。目前已有一些免疫調節(jié)劑應用于臨床治療惡性腫瘤[12]。第二種免疫治療策略是T細胞免疫治療。通過高親和力的T細胞受體或抗腫瘤抗體，使用患者自身的淋巴細胞誘導生成腫瘤特異性反應T細胞[17]。T細胞免疫治療的優(yōu)點主要是修飾細胞增強細胞的活性、體內持久性及對腫瘤免疫抑制環(huán)境的抵抗力[17]。膠質瘤免疫治療的前景可能在于主動免疫接種和免疫檢查點抑制相結合。

4 結論

在本研究中，我們首次成功建立了膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞株。而且，研究發(fā)現(xiàn)，膠質瘤CD133+腫瘤干細胞反應性T細胞對膠質瘤CD133+腫瘤干細胞具有殺傷功能，這種殺傷作用主要通過穿孔素/顆粒酶通路介導。

1. Tresa MG,and Seema Nagpal.History current state of immunotherapy in glioma and brain metastasis[J].Ther Adv Med Oncol，2017，9(5):347-368.

2. Schwartzbaum JA,Fisher JL,Aldape KD,et al.Epidemiology and molecular pathology of glioma[J].Nat Clin Pract Neurol，2006，2:494-503.

3. Teo M,Martin S,Owusu-Agyemang K,et al.A survival analysis of GBM patients in the West of Scotland preand post-introduction of the Stupp regime[J].Br J Neurosurg,2014,28:351-355.

4. Stupp R,Mason WP,van den Bent MJ,et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J].N Engl J Med,2005,352:987-996.

5. Van Meir EG,Hadjipanayis CG,Norden AD,et al.Exciting new advances in neuro-oncology:the avenue to a cure for malignant glioma[J].CA Cancer J Clin,2010,60(3):166-193.

6. Pan Z,Shi Z,Wei H,et al.Magnetofection based on superparamagnetic iron oxide nanoparticles weakens glioma stem cell proliferation and invasion by mediating high expression of microRNA-374a[J].J Cancer,2016,7(11):1 487-1 496.

7. Jaraiz-Rodriguez M,Tabernero MD,Gonzalez-Tablas M,et al.A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration,invasion,and survival through Src,PTEN,and FAK[J].Stem Cell Reports,2017，9(2):451-463.

8. Kim SS,Pirollo KF,Chang EH.Isolation and culturing of glioma cancer stem cells[J].Curr Protoc Cell Biol,2015,67(23):1-10.

9. Dey M,Ulasov IV,Lesniak MS.Virotherapy against malignant glioma stem cells[J].Cancer Lett,2010,289(1):1-10.

10. Oh T,Sayegh ET,Fakurnejad S,et al.Vaccine therapies in malignant glioma[J].Curr Neurol Neurosci Rep,2015,15(1):508.

11. Wu ZB,Qiu C,Zhang AL,et al.Glioma-associated antigen HEATR1 induces functional cytotoxic T lymphocytes in patients with glioma[J].J Immunol Res,2014,2014:131 494.

12. Bloch O.Immunotherapy for malignant glioma[J].Cancer Treat Res,2015,163:143-158.

13. McGranahan T,G Li,S Nagpal.History and current state of immunotherapy in glioma and brain metastasis[J].Ther Adv Med Oncol,2017,9(5):347-368.

14.Williams MA,MJ.Bevan.Effector and memory CTL differentiation[J].Annu Rev Immunol,2007,25:171-192.

15. Dunn GP,H.Okada.Principles of immunology and its nuances in the central nervous system[J].Neuro Oncol,2015,17（7）:3-8.

16. Louveau A,I.Smirnov,TJ.Keyes,et al.Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels[J].Nature,2015,523(7560):337-341.

17.Dietrich PY,DutoitV,WalkerPR.Immunotherapy for glioma:from illusion to realistic prospects[J]Am Soc Clin Oncol Educ Book,2014,34(51):51-59.