廣西云耳耐高溫菌株的室內(nèi)篩選

陳雪鳳，吳圣進(jìn)，龐 航，王燦琴，吳小建，韋仕巖*

(1. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2. 賀州學(xué)院，廣西 賀州 542800)

【研究意義】木耳在廣西有500余年的栽培歷史，是廣西4大食用菌之一。由于近年黑木耳市場(chǎng)價(jià)格穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)效益明顯，因此其栽培面積日益擴(kuò)大。目前廣西黑木耳主栽品種(如916，黑山，新科等)主要是來(lái)自北方或浙江、福建一帶的中低溫型品種，遇到廣西的暖冬氣候容易出現(xiàn)爛包，潮次減少，產(chǎn)量和品質(zhì)下降等現(xiàn)象。云耳是廣西特有的中偏高溫型黑木耳品種，但受高溫氣候影響仍然較大，因此栽培區(qū)域有限，主要集中在桂西北、或桂北山區(qū)。篩選較耐高溫的云耳菌株，對(duì)擴(kuò)大廣西云耳栽培區(qū)域、推進(jìn)廣西云耳特色資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前木耳耐高溫菌株篩選方面的研究主要有：劉佳寧等[1]、李紅等[2]、王進(jìn)和陳文強(qiáng)[3]及高娃等[4]分別采取菌絲體熱激法、菌絲體耐高溫培養(yǎng)法、菌絲不同培養(yǎng)溫度出耳期耐高溫法進(jìn)行黑木耳的耐高溫菌株篩選，并篩選出適合黑龍江、遼寧、陜西等地栽培的高溫菌株。李發(fā)盛等[5-6]、王燦琴等[7]對(duì)廣西百色野生云耳生態(tài)環(huán)境、生物學(xué)特性進(jìn)行了研究并進(jìn)行了馴化栽培；韋蘭英[8]和郎寧[9]利用本地化原料桑枝進(jìn)行廣西云耳栽培技術(shù)研究，篩選出利用桑枝栽培云耳的高產(chǎn)栽培配方，總結(jié)出利用桑枝栽培云耳的栽培技術(shù)方法。【本研究切入點(diǎn)】有關(guān)黑木耳的研究主要集中在黑木耳食藥用成分提取、產(chǎn)品加工、高產(chǎn)栽培技術(shù)、高產(chǎn)菌株的選育方面，而對(duì)耐高溫菌株的篩選較少，特別是廣西野生云耳耐高溫品種篩選研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)觀察比較15個(gè)菌株在不同溫度下菌絲生長(zhǎng)情況及在高溫條件下菌絲的恢復(fù)情況，篩選出菌絲體較耐高溫的菌株，獲得相對(duì)耐高溫的種質(zhì)資源材料，為今后選育適合廣西地區(qū)栽培的耐高溫優(yōu)良云耳品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株15個(gè)， 其中916為廣西主栽品種，來(lái)源于浙江麗水，其余菌株為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所野生分離所得，并于2015-2016年通過(guò)出菇試驗(yàn)初步篩選。具體菌株編號(hào)為：YE1、YE2、HME2、TY013、TY024、TY026、TY041、TY051、TY063、TY071、TY072、TY073、YE(a)、YE(b)、916。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA綜合培養(yǎng)基：土豆200 g、 葡萄糖20 g 、瓊脂20 g 、七水硫酸鎂2 g、磷酸二氫鉀2 g、蒸餾水1000 mL，pH值為中性。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株在不同溫度下的菌落生長(zhǎng)情況比較 試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)溫度梯度(25，28，31，34，37，40 ℃)，每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)。將活化6 d的菌株菌絲圓片(直徑6 mm)接種到PDA綜合培養(yǎng)基(培養(yǎng)皿直徑9 cm)中央，分別置于相應(yīng)溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

菌絲生長(zhǎng)速率 (mm/d) = 菌落半徑 (mm) / 生長(zhǎng)天數(shù) (d)

1.2.2 供試菌株在40 ℃下培養(yǎng)不同天數(shù)后恢復(fù)情況比較 將活化好的菌株菌絲圓片接種到PDA綜合平皿培養(yǎng)基中央，置于 40 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 3、5、7和9 d后，再移出放置于28 ℃恢復(fù)培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理設(shè) 3個(gè)重復(fù)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速率并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 云耳菌株耐高溫鍛煉情況比較 供試菌株活化6 d后，挑取菌落邊緣菌絲塊圓片接種于PDA綜合平皿培養(yǎng)基中央，置于40 ℃下培養(yǎng)5 d，取出在28 ℃下恢復(fù)培養(yǎng)7 d，然后挑選萌發(fā)生長(zhǎng)較好的菌絲塊再接種于PDA綜合培養(yǎng)基上，42 ℃下培養(yǎng)3 d，取出在28 ℃下恢復(fù)培養(yǎng)7 d，再挑選萌發(fā)生長(zhǎng)較好的菌絲塊接種于PDA綜合培養(yǎng)基上，置于45 ℃培養(yǎng)5 h后, 取出在28 ℃下培養(yǎng)7 d。各個(gè)溫度處理恢復(fù)生長(zhǎng)7 d后，測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速率，并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用DPS7.0軟件處理，采用Duncan’s 檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株在不同溫度下菌落生長(zhǎng)情況比較

由表1可見(jiàn)，所有供試菌株菌絲在25～37 ℃的培養(yǎng)條件下均能正常萌發(fā)生長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度為40 ℃時(shí)菌絲只能萌發(fā)，但不能生長(zhǎng)。25～31 ℃時(shí)大部分菌株生長(zhǎng)速率隨溫度升高而加快，31～37 ℃時(shí)生長(zhǎng)速度逐漸下降。31 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較快的是TY026、HME2、YE1、TY071、YE2、YE (a)，其次是TY013、YE (b)、TY073、TY41，但菌絲生長(zhǎng)較好的是HME2、TY026、YE1、TY071、YE2、TY041，因此在31 ℃下綜合生長(zhǎng)情況較好的菌株是HME2、TY026、YE1、TY071、YE2。34 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較快的是TY026、HME2、TY041、TY013、YE2、YE (a)、YE (b)；菌絲生長(zhǎng)較好的是HME2、TY026、YE1、TY071、TY041、YE2、YE (b)、TY013，因此在34 ℃下綜合生長(zhǎng)情況較好的菌株是HME2、TY026、TY041、TY013、YE2、YE (b)。37 ℃時(shí)，菌落生長(zhǎng)情況差異明顯，菌絲生長(zhǎng)較快的是TY041、其次是YE (b)、YE (a)、TY072、TY026、TY073、HME2、YE1；菌絲生長(zhǎng)較好的是TY041、HME2、TY026、YE1、YE (a)、YE (b) ，因此在37 ℃生長(zhǎng)較好的菌株是TY041、YE (a)、YE (b)、TY026、HME2、YE1。

綜上所述，通過(guò)比較31～37 ℃各菌株菌落生長(zhǎng)情況及菌絲的長(zhǎng)勢(shì)可知，在高溫條件下生長(zhǎng)較好且穩(wěn)定的菌株為：HME2、TY026、YE1、TY041、YE2、YE (b)。

表1 供試菌株在不同培養(yǎng)溫度下的菌絲生長(zhǎng)情況

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫(xiě)字母表示相同溫度下不同菌株之間生長(zhǎng)速率差異極顯著(P<0.01)；“ + ” 表示菌絲稀疏，生長(zhǎng)較弱“ + + ” 表示菌絲較密、 生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng); “ + + + ” 表示菌絲濃密、 生長(zhǎng)旺盛。下同。

Note : Capital letters after the column datas indicate the difference in 1 % level of different strains at the same temperate by Duncan's test; + : Mycelium was sparse and grow weaker,+ + : Mycelium was dense and grow strong,+ + +: Mycelium was denser and grow stronger. The same as below.

2.2 供試菌株在40 ℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)不同天數(shù)后的恢復(fù)情況

由表2可見(jiàn)，菌株YE1、TY071、TY026、TY041、HME2在40 ℃下培養(yǎng)3、5 、7、 9 d之后，菌絲生長(zhǎng)速率及長(zhǎng)勢(shì)均比其他菌株好且穩(wěn)定；菌株YE(b)、TY013、TY063、YE2雖然在個(gè)別處理中菌絲生長(zhǎng)速率也快，但其速率不穩(wěn)定或菌絲長(zhǎng)勢(shì)較差。因此，在40 ℃條件下經(jīng)不同天數(shù)培養(yǎng)處理，篩選到菌絲生長(zhǎng)速度快且菌絲潔白致密的菌株5個(gè)：YE1、TY071、TY041、TY026、HME2。

2.3 云耳菌株耐高溫鍛煉情況

由表3可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)40 ℃培養(yǎng)條件下設(shè)置的高溫鍛煉方法處理后，菌株TY041、YE1、TY026、TY071、HME2的菌絲生長(zhǎng)較快且菌落潔白致密，TY063菌絲生長(zhǎng)速度雖快，但菌絲長(zhǎng)勢(shì)不夠好，因此在40 ℃鍛煉條件下表現(xiàn)好的菌株為：TY041、YE1、TY026、TY071、HME2。

經(jīng)42 ℃高溫培養(yǎng)鍛煉后，菌株TY026、TY073菌絲生長(zhǎng)速度最快，其次是TY071、TY041、YE(b)、HME2、TY063，而菌絲長(zhǎng)勢(shì)好的菌株有TY026、YE1、YE2、HME2、TY071、TY041、TY073，因此在42 ℃鍛煉條件下表現(xiàn)良好的菌株為：TY026、HME2、TY071、TY041 、TY073。

經(jīng)45 ℃高溫培養(yǎng)鍛煉后，菌株TY026、TY041菌落生長(zhǎng)速度最快，其次TY073、HME2、 TY071，而且菌絲也生長(zhǎng)潔白致密，因此在45 ℃鍛煉條件下表現(xiàn)良好的菌株為：TY026、TY041 、TY071、TY073、HME2。

經(jīng)40、42、45 ℃高溫鍛煉處理后，菌株TY041、TY026、TY071、HME2、TY073仍能在28 ℃適宜培養(yǎng)條件下穩(wěn)定恢復(fù)生長(zhǎng)，具有較好的耐高溫性。

3 討 論

食用菌育種的最終目的是獲得綜合性狀優(yōu)良的新品種。而抗逆性是食用菌優(yōu)良品種必備的重要性狀，它直接關(guān)系到栽培的成敗和經(jīng)濟(jì)效益的大小。因此，除了豐產(chǎn)性和綜合商品性狀外，耐高溫、低溫性、抗病性、基質(zhì)適應(yīng)性等抗逆性的篩選、鍛煉是食用菌育種中種質(zhì)創(chuàng)新的重要目標(biāo)[10]。食用菌菌絲體的耐高溫性狀與豐產(chǎn)性緊密連鎖，因此耐高溫性狀的篩選同時(shí)也是豐產(chǎn)性狀的篩選[11]。在本研究的耐高溫性試驗(yàn)中，表現(xiàn)比較好的菌株YE1、HME2、TY026、TY041、TY071 在2015-2016年出菇試驗(yàn)中也是產(chǎn)量相對(duì)較高的品種。

表2不同云耳菌株在40 ℃條件下培養(yǎng)不同時(shí)間后菌絲恢復(fù)生長(zhǎng)情況

表3 供試菌株高溫鍛煉后的菌絲長(zhǎng)勢(shì)比較

本試驗(yàn)的大部分云耳菌株菌絲在培養(yǎng)皿中經(jīng)過(guò)40 ℃的高溫處理后轉(zhuǎn)移到28 ℃正常溫度培養(yǎng)，均能恢復(fù)正常生長(zhǎng)，這說(shuō)明云耳菌絲體的耐高溫性比較強(qiáng)。而在生產(chǎn)中當(dāng)遇到35 ℃以上過(guò)高氣溫及環(huán)境條件調(diào)控不當(dāng)?shù)那闆r時(shí)，極易發(fā)生熱害爛包現(xiàn)象，其原因可能是在試驗(yàn)中的菌絲受高溫處理一定時(shí)間后，恢復(fù)正常溫度培養(yǎng)，在培養(yǎng)皿中能及時(shí)散熱，而在生產(chǎn)中菌包受到高溫危害后，不能及時(shí)疏通散熱恢復(fù)正常生長(zhǎng)條件，當(dāng)溫度超過(guò)菌絲體耐受程度時(shí)，其活力下降甚至死亡。

在試驗(yàn)中，野生分離的云耳中，半數(shù)以上的菌株經(jīng)高溫條件下培養(yǎng)、鍛煉后，菌絲總體恢復(fù)生長(zhǎng)能力比916好，說(shuō)明廣西云耳菌株菌絲體在耐高溫性上具有優(yōu)勢(shì)。

經(jīng)過(guò)一系列的高溫培養(yǎng)、鍛煉，菌株TY026、TY041、HME2菌絲體的生長(zhǎng)速度及菌絲長(zhǎng)勢(shì)均相對(duì)較穩(wěn)定。YE1雖然在42～45 ℃高溫鍛煉的兩個(gè)處理中表現(xiàn)稍差，但在25～37 ℃條件下及40 ℃培養(yǎng)不同天數(shù)條件下培養(yǎng)后的恢復(fù)情況均表現(xiàn)較好；TY071在37 ℃培養(yǎng)中表現(xiàn)一般，但在40 ℃培養(yǎng)不同天數(shù)條件下及40～45 ℃的高溫鍛煉中菌表現(xiàn)穩(wěn)定且良好。

黑木耳的菌絲體對(duì)高溫有一定的忍耐性，菌絲體受短暫高溫影響后，都可以正常地恢復(fù)生長(zhǎng)。品種對(duì)高溫條件忍受的時(shí)間越長(zhǎng)、程度越大，說(shuō)明該品種的耐高溫能力越強(qiáng)。在前人研究中[1-4]，菌絲體耐高溫篩選方法中，熱處理培養(yǎng)時(shí)間短、高溫條件單一、缺乏菌絲體由低溫到高溫的馴化適應(yīng)性、穩(wěn)定性鍛煉。而本研究在耐高溫菌株篩選中，采取了菌絲體在25～40 ℃不同梯度溫度培養(yǎng)、40 ℃高溫條件培養(yǎng)時(shí)間由3 d延長(zhǎng)到9 d、從40～45 ℃高溫馴化鍛煉等3種方法進(jìn)行試驗(yàn)，綜合該3種方法篩選出的高溫菌株更具有代表性及穩(wěn)定性。

不同種類(lèi)的食用菌，同一種類(lèi)的不同菌株，同一菌株的不同生育期，對(duì)高溫的耐受性不盡相同。品種的耐高溫性鍛煉和篩選，首先要從菌絲體的耐高溫性篩選開(kāi)始，獲得相對(duì)耐高溫的品種后再進(jìn)行農(nóng)藝性狀的強(qiáng)化和穩(wěn)定性測(cè)試。本研究中篩選出的幾個(gè)菌株，其菌絲體耐高溫表現(xiàn)較好，但在出菇期間的菌絲體及子實(shí)體是否同樣耐高溫，還有待進(jìn)一步測(cè)試。

4 結(jié) 論

在一系列高溫條件的培養(yǎng)及處理下，云耳菌株TY026、TY041、HME2菌絲體的生長(zhǎng)速度及菌絲長(zhǎng)勢(shì)均表現(xiàn)相對(duì)較穩(wěn)定，可以初步認(rèn)定為菌絲體耐高溫品種。TY071、YE1也是菌絲體耐高溫性較好的菌株，可以與TY026、TY041、HME2一同進(jìn)行出菇期間的耐高溫性測(cè)試。

[1]劉佳寧，張介馳，韓增華，等. 十種黑木耳菌絲體的高溫耐受性研究[J]. 黑龍江科學(xué), 2015(6): 16-17.

[2]李 紅，肖千明，孫冠中. 遼寧省主栽黑木耳菌株菌絲耐高溫能力試驗(yàn)[J]. 食用菌, 2015(2): 21-22.

[3]王 進(jìn)，陳文強(qiáng). 紫外誘變選育秦巴山區(qū)黑木耳耐高溫菌株的研究[J]. 陜西理工學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 30(5): 46-50.

[4]高 娃，韓增華， 戴肖東，等. 木耳不同培養(yǎng)溫度出耳期耐高溫比較[J]. 中國(guó)食用菌, 2014, 33(6) : 26-28.

[5]李發(fā)盛，李 槐，何達(dá)崇，等. 廣西百色野生云耳生態(tài)環(huán)境調(diào)查[J]. 食用菌, 2008(5): 13-14.

[6]李發(fā)盛，莫祺暉，韋星明，等. 云耳百云6號(hào)的生物學(xué)特性試驗(yàn)[J]. 食用菌, 2009(3): 22-24.

[7]王燦琴，熊建文， 陳麗新，等. 五個(gè)野生云耳菌株的比較試驗(yàn)[J]. 食用菌, 2012(2): 21-24.

[8]韋蘭英. 桑枝栽培云耳技術(shù)[J]. 廣西農(nóng)學(xué)報(bào), 2009, 24(3): 75-76.

[9]郎 寧. 桑枝屑栽培云耳技術(shù)[J]. 食用菌, 2008(4): 38.

[10]張金霞，邊銀丙，謝寶貴，等. 中國(guó)食用菌菌種學(xué)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2011: 128-129.

[11]Larraya L M, Alfonso M, Pisabarro A G, et al. Mapping of genomic regions(quantitative trait loci) controlling production and quality in industrial cultures of the edible BasidionmycetePleurotusostreatus[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(6): 3617-3625.