基于PCR-RFLP技術(shù)分析H-FABP基因在5個豬群體中的多態(tài)性

吳華莉，涂尾龍，曹建國，都啟晶，常談永松*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海市調(diào)控生物學(xué)重點實驗室，上海 200241；3.上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201302；4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；5.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；6.淮安洪泰良種豬繁育有限公司，江蘇 淮安 223472)

【研究意義】豬肉的品質(zhì)和口感與豬肉的嫩度、風(fēng)味和多汁性相關(guān)，而存在于肌纖維束周圍結(jié)締組織中的肌內(nèi)脂肪(IMF)影響著豬肉嫩度。一般認(rèn)為IMF 達(dá)到2 %較為適宜。豬肉IMF的沉積與遺傳變異有關(guān)。【前人研究進(jìn)展】脂肪酸結(jié)合蛋白家族(FABPs)能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸，是運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)脂肪酸最重要的載體，也有研究表明FABPs有可能參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸雙向轉(zhuǎn)運(yùn)過程[1]。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart fatty acid binding protein，H-FABP)是FABPs中的一員。H-FABP基因不僅在各個組織都有表達(dá)，尤其在心肌和骨骼肌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)[2]。Gerbens等發(fā)現(xiàn)H-FABP基因是調(diào)控豬肉IMF含量的重要候選基因[3]。國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)H-FABP基因與IMF具有極強(qiáng)的相關(guān)性[4-5]?！颈狙芯壳腥朦c】本研究目的在于檢測H-FABP基因在上海地區(qū)5個豬群體中的多態(tài)性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以期為上海地區(qū)這5個豬群肉質(zhì)方面的育種工作提供分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

采集組織樣品包括：杜洛克(100頭)、長白豬(80頭)、大白豬(150頭)來自上海祥欣畜禽有限公司，申農(nóng)豬(80頭)來自上海富民農(nóng)場，梅山豬(140頭)來自于上海狀元豬場，采集部位為耳組織塊。使用試驗試劑Taq酶購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，HaeШ酶購于寶生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用AXYGEN基因組試劑盒提取組織DNA，測定DNA濃度，稀釋DNA，使每管濃度達(dá)到30 ng/mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物及PCR擴(kuò)增 上游引物：5’-ATTGCTTCGGTGTGTTTGAG-3’；下游引物：5’-TCAGG AATGGGAGTTATTGG-3’[6]。PCR擴(kuò)增條件為： 94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，要求目的條帶清晰、單一無雜帶，符合條件的PCR產(chǎn)物可以進(jìn)行酶切試驗，采用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。

1.2.3 基因型分析 豬H-FABP基因PCR擴(kuò)增片段為816 bp，第2內(nèi)含子區(qū)域存在3處HaeШ酶切位點，其中一個酶切位點存在多態(tài)性，具體的基因型判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。根據(jù)瓊脂糖檢測酶切結(jié)果，不同基因型分別選取3個樣品進(jìn)行測序?；蛐团卸〞r需結(jié)合瓊脂糖檢測結(jié)果和測序結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 H-FABP基因酶切后基因型判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-RFLP檢測

用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，目的條帶大小與預(yù)期一致。圖1顯示，DD型為3條帶，dd型為4條帶，Dd型雜合子為5條帶。根據(jù)電泳檢測結(jié)果統(tǒng)計每個個體的基因型。

2.2 H-FABP基因在5個豬群體中的基因型頻率和等位基因頻率

采用PCR-RFLP技術(shù)，在5個豬群體中進(jìn)行H-FABP基因的多態(tài)性檢測。具體的基因型頻率和等位基因頻率見表2。

由表2可見，H-FABP基因各基因型在5個豬群體中的分布情況不同：在杜洛克群體中以dd型為主要基因型，有較少的雜合子Dd的基因型和DD基因型，占優(yōu)勢的是d等位基因；在大白豬群體中占優(yōu)勢的是Dd基因型，D和d等位基因頻率均勻分布；在申農(nóng)豬群體中檢測出3種基因型，主要為dd型，d等位基因頻率高于D等位基因頻率；在長白豬群體中只檢測出dd基因型；在梅山豬群體中只檢測出DD基因型。本研究結(jié)果顯示H-FABP基因在杜洛克、大白、申農(nóng)豬群體中檢測出3種基因型，但在長白和梅山豬群體中出現(xiàn)偏態(tài)現(xiàn)象。

3 討 論

H-FABP基因不僅參與骨骼肌胞內(nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且在脂類代謝方面發(fā)揮重要作用[7]。H-FABP基因突變位點已被證實和杜洛克*梅山豬、杜洛克、杜洛克*長白豬的脂肪性狀有關(guān)[8]。有研究表明HaeШ酶切位點產(chǎn)生dd型比DD型的H-FABP基因mRNA表達(dá)量低，比DD型閹豬的背最長肌IMF高0.24，達(dá)到顯著水平(P<0.05)，比DD型母豬的背最長肌IMF高0.02，影響不顯著[2]。本研究在梅山豬群體內(nèi)只檢測出DD型，這與已報道我國地方豬種在此位點缺乏多態(tài)性的研究結(jié)果一致[9-10]。本研究在長白豬群體內(nèi)只檢測出dd型，這與林萬華等檢測H-FABP基因在長白群體中檢測出3個基因型的結(jié)果不同，造成差異的原因①可能與本次樣品都為長白母豬有關(guān)，②采樣豬種來源不同，但以上推論需要進(jìn)一步驗證。

圖1 H-FABP基因酶切檢測Fig.1 Results of H-FABP gene digested by endonuclease

表2 H-FABP基因在5個豬群體中的基因型頻率和等位基因頻率

此外，研究者發(fā)現(xiàn)H-FABP基因5'上游區(qū)域存在HinfⅠ酶切位點、第2內(nèi)含子區(qū)域存在MspⅠ和HaeⅢ酶切位點，這些位點與不同豬種IMF相關(guān)性并不完全一致[11-12]。研究證實國外豬種3個酶切位點產(chǎn)生“aa-dd-HH”型與豬高肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)。檢測110 kg體重杜洛克時，發(fā)現(xiàn)dd型的IMF含量較高，而DD型豬背膘較低。H-FABP基因多態(tài)性影響IMF含量變化原因可能在于能更有效的增加脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)或者調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的不同[3]。Pang等也證實dd型脂肪細(xì)胞的沉積能力高于DD型[13]。 Chao等研究證實DD型個體瘦肉率高于dd型[14]。本研究檢測H-FABP基因在dd型在杜洛克、長白和申農(nóng)豬群體內(nèi)頻率均大于0.5以上,在育種過程中要關(guān)注這3個豬群體DD型個體比例，可改善豬肉合適IMF含量。

有學(xué)者研究H-FABP基因的mRNA 表達(dá)水平與蛋白質(zhì)濃度時，發(fā)現(xiàn)兩者之間相關(guān)性較低，說明該基因的表達(dá)調(diào)節(jié)不受轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而受翻譯調(diào)控。豬體內(nèi)IMF特性變化與脂肪沉積的生長周期有關(guān)，在豬生長過程中觀察IMF含量變化，不適當(dāng)?shù)牟杉c監(jiān)測H-FABP基因mRNA 量和蛋白質(zhì)水平并不能表明IMF的遺傳變異情況，通常選擇脂肪沉積后180 d日齡屠宰測定[2]。此外，背最長肌的纖維類型有可能也影響H-FABP基因檢測結(jié)果[15]。

動物育種工作者們關(guān)于H-FABP基因mRNA、蛋白質(zhì)以及不同酶切位點的多態(tài)性分析，目的都是為提高或者降低豬肉IMF，改善豬肉品質(zhì)方面的育種提供輔助遺傳標(biāo)記。本研究的結(jié)果可為5個豬群體IMF改良提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。尤其在實際育種過程發(fā)現(xiàn)本實驗室選育“長白*大白*二花臉”雜交品系申農(nóng)豬的脂肪性狀不理想，這可能與申農(nóng)豬群體中H-FABP基因dd型較多有關(guān)，接下來可結(jié)合申農(nóng)豬IMF測定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析，期望為該品系肉質(zhì)改良提供有價值的參考。

4 小 結(jié)

本研究對H-FABP基因第2個內(nèi)含子區(qū)域HaeШ酶切位點進(jìn)行多態(tài)分析，確定5個豬群體中該位點的優(yōu)勢基因型，后續(xù)可結(jié)合IMF性狀進(jìn)一步分析，從而進(jìn)行標(biāo)記輔助育種工作。

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