大孔樹(shù)脂純化黑豆異黃酮的工藝優(yōu)化

張 星，董 欣，劉振春，鄭 麗，鄒基豪，崔晶蕾，李澤鴻

(1長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué) 人文信息學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118;2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) a食品科學(xué)與工程學(xué)院，b生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

黑豆(Glycinemax(L.)merr)為被子植物門(Ngiospermae)雙子葉植物綱(Dicotyledons) 豆科(Leguminosaesp)大豆屬(GlycineWild) 植物，又被稱為櫓豆、料豆、零烏豆。其外形呈卵圓形或球形，表皮呈黑色或深綠色，全國(guó)多地均有產(chǎn)出，其中東北產(chǎn)量居全國(guó)首位[1]。黑豆中含有豐富的人體必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素等，同時(shí)也含有多種生物活性物質(zhì)，如異黃酮、多糖等。所以黑豆也被譽(yù)為可被大力開(kāi)發(fā)的食藥兼用型健康食品[2]。黑豆中的異黃酮是一種能夠很好地抑制結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌等癌癥的植物性雌激素，同時(shí)異黃酮還可以防治中老年骨質(zhì)疏松癥，預(yù)防多種心血管疾病，對(duì)于改善婦女更年期綜合癥及增加雌激素活性也有明顯的作用[3-5]。但黑豆中的異黃酮遇高溫易氧化，因此在提取過(guò)程中要避免溫度過(guò)高[6-7]。

目前應(yīng)用較為廣泛的異黃酮分離方法有萃取法、沉淀法、柱層析法等[8-9]。大孔樹(shù)脂吸附法是近年來(lái)針對(duì)有機(jī)高聚吸附劑發(fā)展起來(lái)的新型異黃酮分離法，與傳統(tǒng)方法相比，這種方法具有使用周期長(zhǎng)、成本低、毒性小等諸多優(yōu)點(diǎn)[10-12]。黑豆異黃酮主要是指以3-苯并吡喃酮為母核的化合物，其骨架結(jié)構(gòu)與大孔樹(shù)脂分子相近，因此將大孔吸附樹(shù)脂的吸附性能與分子篩相結(jié)合，可以從黑豆粗提物中有選擇地吸附其中的有效成分，去除雜質(zhì)。但目前有關(guān)利用大孔樹(shù)脂分離純化黑豆異黃酮的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究利用響應(yīng)面優(yōu)化和回歸分析方法確定利用大孔樹(shù)脂分離純化黑豆粗黃酮的最優(yōu)工藝條件，并通過(guò)超高效液相色譜分析法，準(zhǔn)確測(cè)定純化黑豆異黃酮的成分，以期為黑豆的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

東北青仁黑豆，市售。染料木素標(biāo)準(zhǔn)品、大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品、大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品、染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，上海雅吉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、HCl、NaOH、磷酸鈉等為分析純；甲醇色譜純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；大孔吸附樹(shù)脂NKA-9、AB-8、D101、HPD100、DM301，北京索寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1502CN電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；Q-250A3高速多功能粉碎機(jī)，上海冰都電器有限公司；NJL07-3型實(shí)驗(yàn)用微波爐，南京杰全微波設(shè)備有限公司；TU-1901紫外分光光度計(jì)，北京普希通用儀器有限責(zé)任公司；JY99-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；LXJ-B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；超高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)沃特斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑豆異黃酮的提取及含量測(cè)定 (1)異黃酮提取。根據(jù)張星等[13]的方法，將脫脂黑豆粉末放入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液中提取，經(jīng)多次試驗(yàn)，確定提取條件為料(g)液(mL)比1∶20、超聲波功率310 W，微波功率420 W，微波輻射時(shí)間120 s，經(jīng)離心處理后得黑豆異黃酮粗品備用。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱取染料木素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液定容至10 mL，配制成0.1 mg/mL的染料木素標(biāo)準(zhǔn)溶液；量取1 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，加蒸餾水定容至10 mL，作為空白對(duì)照組；再分別準(zhǔn)確量取0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mL染料木素標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇定容至1 mL后再加蒸餾水定容至10 mL。以空白組為對(duì)照，在波長(zhǎng)200～600 nm內(nèi)掃描染料木素標(biāo)準(zhǔn)溶液，最終確定黑豆異黃酮的最大吸收波長(zhǎng)為260 nm。利用紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)260 nm處測(cè)定其吸光度；并將測(cè)定出的吸光度作為縱坐標(biāo)(Y)，黑豆異黃酮質(zhì)量濃度(μg/mL)作為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黑豆異黃酮的含量。

1.3.2 黑豆異黃酮的純化 (1)大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理。將NKA-9、AB-8、D101、HPD100、DM301 5種樹(shù)脂，分別浸泡于體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液中24 h，然后用蒸餾水洗滌至中性；再分別用體積分?jǐn)?shù)為5%的NaOH溶液浸泡12 h，洗滌至中性；最后用體積分?jǐn)?shù)為5%的HCl浸泡12 h，洗滌至中性，靜置待用[15-16]。

(2)靜態(tài)吸附試驗(yàn)及相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的5種濕樹(shù)脂各1 g，分別裝入100 mL的具塞錐形瓶中，各加入50 mL黑豆粗黃酮溶液，置于搖床上振蕩24 h，使樹(shù)脂吸附充分。振蕩過(guò)程中每隔0.5 h吸取0.1 mL上清液，測(cè)定其中的黑豆異黃酮質(zhì)量濃度，據(jù)此計(jì)算吸附量[17-18]。取最終吸附的樹(shù)脂，濾去上清液，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，搖床振蕩24 h，測(cè)定其中黑豆異黃酮質(zhì)量濃度，最后計(jì)算吸附率、解吸率、洗脫率、回收率和純度，計(jì)算公式如下：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：Co為吸附前溶液中黑豆異黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce為吸附后溶液中黑豆異黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；Cd為解吸溶液中黑豆異黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；Vd為解吸溶液體積，mL；Cf為吸附溶液中黑豆異黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；Vf為吸附溶液的體積，mL；Vo為吸附前溶液的體積，mL；W為干膏質(zhì)量，mg。

1.4 大孔樹(shù)脂吸附的單因素試驗(yàn)

1.4.1 上樣液質(zhì)量濃度 用靜態(tài)吸附試驗(yàn)中吸附能力最強(qiáng)的AB-8大孔吸附樹(shù)脂，分別飽和吸附質(zhì)量濃度為3，5，7，9，11 mg/mL、體積為60 mL、pH值為2的黑豆異黃酮提取液，根據(jù)其吸附量計(jì)算樹(shù)脂對(duì)黑豆異黃酮的吸附率，確定上樣液的最佳質(zhì)量濃度。

1.4.2 上樣液pH值 取7 mg/mL黑豆異黃酮提取液60 mL，以2 mL/min的上樣流速通過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂，通過(guò)柱體時(shí)pH分別為1，2，3，4，5，根據(jù)吸附率選擇最佳的上樣液pH值。

1.4.3 上樣液流速 將7 mg/mL的黑豆異黃酮提取液分別以1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL/min的流速通過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂，準(zhǔn)確測(cè)定黑豆異黃酮質(zhì)量濃度，根據(jù)泄漏點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)間選擇最佳上樣流速[19]。

1.5 大孔樹(shù)脂吸附黑豆異黃酮工藝的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇上樣液質(zhì)量濃度、pH值、上樣液流速3個(gè)變量，采用響應(yīng)面分析法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，以吸附率為參照值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)[20-21]。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1。

表1 大孔樹(shù)脂吸附黑豆異黃酮工藝條件優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)方案Table 1 Factors and levels for response surface analysis affecting the adsorption of black soybean isoflavone by macroporous resin

1.6 大孔吸附樹(shù)脂解吸的單因素試驗(yàn)

1.6.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 從經(jīng)濟(jì)、適用角度考慮，本研究選取乙醇作為黑豆異黃酮洗脫劑，由于洗脫劑體積分?jǐn)?shù)是影響AB-8大孔樹(shù)脂洗脫效果的重要因素，所以將飽和吸附后的AB-8大孔吸附樹(shù)脂分別用體積分?jǐn)?shù)為0，20%，40%，60%，80%的乙醇溶液洗脫，根據(jù)黑豆異黃酮洗脫率確定乙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)[22]。

1.6.2 乙醇用量 黑豆異黃酮的解吸效果由多個(gè)因素綜合決定，其中洗脫劑的用量除了要考慮其對(duì)解吸效果的影響外，還要綜合考慮成本因素。所以本試驗(yàn)將飽和吸附后的AB-8大孔吸附樹(shù)脂分別用20，40，60，80，100，120，140，160，180 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)黑豆異黃酮洗脫率來(lái)確定乙醇的最適用量。

1.7 黑豆異黃酮的二次純化試驗(yàn)

在上述優(yōu)化的吸附和解吸條件下，將黑豆粗黃酮經(jīng)過(guò)AB-8型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行一次純化，記錄結(jié)果后再以相同條件進(jìn)行二次純化，獲得最終純化的黑豆異黃酮。

1.8 黑豆異黃酮組分的超高效液相色譜分析

1.8.1 樣品的制備 將大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素4種標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于體積分?jǐn)?shù)80%甲醇中，然后將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和黑豆異黃酮粗提物經(jīng)AB-8型大孔吸附樹(shù)脂純化，所得液體分別經(jīng)0.45 nm濾膜過(guò)濾備測(cè)。

1.8.2 色譜條件 色譜柱為BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μL；流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)10%甲醇(A)和體積分?jǐn)?shù)0.3%乙酸(B)；流速0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆異黃酮的提取

黑豆異黃酮質(zhì)量濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.112 65X-0.058 85，R2=0.999 25(圖1)。在波長(zhǎng)260 nm下測(cè)定其吸光度，按照回歸方程算出待測(cè)樣品中的黑豆異黃酮含量為(4.73±0.2) mg/g。

2.2 黑豆異黃酮吸附樹(shù)脂的篩選

由圖2可知，5種大孔樹(shù)脂對(duì)黑豆異黃酮均有一定的吸附作用，且以AB-8對(duì)黑豆異黃酮的吸附能力最強(qiáng)，7 h時(shí)其吸附量可達(dá)14.01 mg/g。這可能是由于異黃酮類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)由極性糖基和非極性黃酮母核結(jié)構(gòu)組成，總體顯示弱極性;而AB-8型樹(shù)脂也為弱極性，且其所具有的酚羥基結(jié)構(gòu)可以作為較好的羥基供體，所以可以很好地吸附黑豆異黃酮。吸附時(shí)間小于7 h時(shí)，AB-8樹(shù)脂的吸附量增幅和吸附速率快速增加；超過(guò)7 h后，吸附曲線則趨于平緩，吸附量增加緩慢。因此從生產(chǎn)周期以及成本角度考慮，將AB-8作為吸附黑豆異黃酮的大孔樹(shù)脂，最佳吸附時(shí)間為7 h。

圖1 黑豆異黃酮含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for determination of black soybean isoflavone

2.3 大孔樹(shù)脂吸附黑豆異黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響 圖3為黑豆異黃酮粗提物質(zhì)量濃度對(duì)AB-8大孔樹(shù)脂吸附效果的影響。從圖3可以看出，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加，AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)黑豆異黃酮的吸附率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度達(dá)到7 mg/mL時(shí)，吸附效果最好，吸附率達(dá)到87.92%；之后，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度增加時(shí)，吸附率反而有所下降。因此，確定AB-8大孔樹(shù)脂吸附黑豆異黃酮時(shí)的上樣液質(zhì)量濃度為7 mg/mL。

2.3.2 上樣液pH對(duì)吸附效果的影響 從圖4可以看出，在pH值不斷增大的過(guò)程中，AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)黑豆異黃酮的吸附率表現(xiàn)為先增加后降低。且當(dāng)pH值為2時(shí)，其吸附率最高達(dá)到87.31%。因此，選擇pH值為2進(jìn)行AB-8大孔樹(shù)脂吸附黑豆異黃酮試驗(yàn)。究其原因，可能是由于異黃酮類化合物多數(shù)為多羥基酚類，其弱酸性特質(zhì)導(dǎo)致其溶解度在酸性條件下降低，因此利于被樹(shù)脂吸附。但當(dāng)pH降至1時(shí)，因酸性過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致沉淀析出，所以吸附率也不高。

圖3 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)AB-8大孔樹(shù)脂吸附黑豆異黃酮效果的影響Fig.3 Effect of solution concentration on adsorption of black soybean isoflavone by AB-8

2.3.3 上樣液流速對(duì)吸附效果的影響 圖5為將黑豆異黃酮粗提物以不同流速通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂時(shí)的吸附效果。圖5顯示，當(dāng)流速為1.5，2 mL/min時(shí)，吸附率較高，當(dāng)流速大于2 mL/min時(shí)吸附率呈現(xiàn)下降態(tài)勢(shì)，證明在此流速下黑豆異黃酮不能較好地被吸附。這可能是由于過(guò)快的流速導(dǎo)致溶質(zhì)分子不能全面擴(kuò)散到樹(shù)脂表層，因而減少了吸附量。綜合考慮試驗(yàn)用時(shí)和泄漏效果雙重因素，最終選擇2 mL/min為最佳流速。

2.4 大孔樹(shù)脂吸附黑豆異黃酮工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，上樣液質(zhì)量濃度、pH值和流速3種因素對(duì)黑豆異黃酮的吸附率均有一定影響，所以以上樣液質(zhì)量濃

度(X1)、pH值(X2)、流速(X3)進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖5 上樣液流速對(duì)AB-8大孔樹(shù)脂吸附黑豆異黃酮效果的影響Fig.5 Effect of solution velocity on adsorption of black soybean isoflavone by AB-8

試驗(yàn)號(hào)No.上樣液質(zhì)量濃度(X1)MassconcentrationofsamplesolutionpH(X2)上樣液流速(X3)Sampleliquidflowrate吸附率/%Adsorptionrate100087.9621-1068.3230-1161.214-1-1057.475-11071.69601178.497-10-178.42800087.929-10166.261010-186.08110-1-174.361201-185.921311080.541400088.561500086.471610179.311700087.08

2.4.2 回歸方程的建立 利用Design-expert 8.0.6 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，回歸分析結(jié)果見(jiàn)表3。黑豆異黃酮吸附率(Y)對(duì)上樣液質(zhì)量濃度(X1)、pH值(X2)、上樣液流速(X3)的二次多項(xiàng)回歸方程為：

表3 大孔樹(shù)脂吸附黑豆異黃酮工藝優(yōu)化回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of optimal regression equations for adsorption of black soybean isoflavone by macroporous resin

(1)上樣液質(zhì)量濃度與pH值之間的交互作用。在上樣液流速為2 mL/min時(shí)，上樣液質(zhì)量濃度與pH值交互作用的等高線和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。

圖6 pH值與上樣液質(zhì)量濃度交互作用對(duì)黑豆異黃酮吸附率的影響Fig.6 Effect of pH and concentration of sample solution interaction on adsorption rate of soybean isoflavones

由圖6可以看出，在對(duì)黑豆異黃酮吸附率的交互作用中，pH值曲面較上樣液質(zhì)量濃度曲面較平緩，說(shuō)明pH值對(duì)吸附率的影響較為明顯。等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明兩者之間有顯著的交互作用。

(2)上樣液質(zhì)量濃度與上樣液流速的交互作用。在pH值為2時(shí)，上樣液質(zhì)量濃度與上樣液流速交互作用的等高線及響應(yīng)面圖見(jiàn)圖7。從圖7可以看出，在對(duì)黑豆異黃酮吸附率的交互作用中，上樣液質(zhì)量濃度曲面較上樣液流速曲面變化平緩，說(shuō)明上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響大于上樣液流速。等高線為橢圓形，說(shuō)明兩者之間的交互作用顯著。

(3)pH值與上樣液流速的交互作用。在上樣液質(zhì)量濃度為7 mg/mL時(shí)，pH值與上樣液流速的交互作用等高線和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖8。由圖8可以看出，在對(duì)黑豆異黃酮吸附率的交互作用中，pH值曲面緩于上樣液流速曲面，說(shuō)明pH值對(duì)黑豆異黃酮吸附率的影響大于上樣液流速。橢圓形等高線說(shuō)明pH值與上樣液流速的交互作用對(duì)黑豆異黃酮吸附率有明顯影響。

圖7 上樣液流速與上樣液質(zhì)量濃度交互作用對(duì)黑豆異黃酮吸附率的影響Fig.7 Effect of velocity and concentration of sample solution interaction on adsorption rate of soybean isoflavones

圖8 上樣液流速與pH值交互作用對(duì)黑豆異黃酮吸附率的影響Fig.8 Effect of sample liquid velocity and pH on adsorption rate of soybean isoflavones

2.4.4 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證 用Design expert 8.0.6對(duì)2.4.2中回歸方程進(jìn)行分析，得出AB-8大孔樹(shù)脂吸附黑豆異黃酮的最佳條件為：上樣液質(zhì)量濃度7.47 mg/mL，pH值2.27，上樣液流速1.54 mL/min，預(yù)測(cè)在此條件下的吸附率為91.392%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將上述條件校正為：上樣液質(zhì)量濃度7.47 mg/mL，pH值2.27，上樣液流速2 mL/min，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的吸附率分別為91.053%，90.966%，91.069%，平均吸附率為91.029%，與預(yù)測(cè)值接近，表明所建立的回歸模型可以較好地反映AB-8大孔樹(shù)脂吸附黑豆異黃酮的效果。

2.5 大孔樹(shù)脂解吸影響的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響 圖9為不同體積分?jǐn)?shù)乙醇作為洗脫劑對(duì)黑豆異黃酮洗脫率的影響。由圖9可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，洗脫率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，黑豆異黃酮能被有效洗脫出來(lái)，洗脫率達(dá)到78.32%；而當(dāng)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)升高至80%時(shí)，洗脫率降至62.71%。從洗脫液的顏色也可以明顯看出，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇時(shí)洗脫液顏色更接近于深棕色，且顏色保持時(shí)間較長(zhǎng)。綜上所述，選擇體積分?jǐn)?shù)60%乙醇作為最適條件。

2.5.2 洗脫劑用量對(duì)解吸效果的影響 圖10為不同體積乙醇洗脫AB-8大孔樹(shù)脂后所得的黑豆異黃酮洗脫率。從圖10可知，隨著洗脫劑體積增加，黑豆異黃酮洗脫率逐漸上升。當(dāng)乙醇體積為80 mL時(shí),黑豆異黃酮洗脫率達(dá)到68.89%；體積大于80 mL時(shí)，洗脫率增幅減小至5%以下，所以從經(jīng)濟(jì)適用角度考慮，選取洗脫劑體積為80 mL。

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑豆異黃酮解吸效果的影響Fig.9 Effect of ethanol concentration on the adsorption by AB-8

2.6 黑豆異黃酮的二次純化

在優(yōu)化的最佳工藝下，將黑豆粗黃酮第一次通過(guò)AB-8型大孔吸附樹(shù)脂，獲得的黑豆異黃酮純度達(dá)到72.42%，比未純化前(純度21.36%)提高了近3倍，回收率為81.34%。將一次純化后的黑豆異黃酮在相同條件下再次過(guò)柱，所得黑豆異黃酮純度為78.56%，較一次純化提高了8.48%，回收率為81.66%。

2.7 黑豆異黃酮組分的超高效液相色譜分析

圖11為黑豆異黃酮4種標(biāo)準(zhǔn)品所得的超高效液相色譜(UPLC)圖。

A1峰為大豆苷，A2峰為染料木苷，A3峰為大豆苷元，A4峰為染料木素A1.Daidzin;A2.Genistin;A3.Isoflavoues aglycone;A4.Genistein圖11 黑豆異黃酮4種單體的UPLC結(jié)果Fig.11 UPLC chromatograms of four components of single black soybean isoflavone

圖12為選用上樣液質(zhì)量濃度7.47 mg/mL、上樣液pH 2.27、上樣液流速2 mL/min、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)60%、洗脫劑用量80 mL下，一次純化得到的黑豆異黃酮提取物。圖13為二次純化后的黑豆異黃酮，與圖11中各峰的出峰時(shí)間相比可以推斷，圖12與圖13中所對(duì)應(yīng)峰依次可能為大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素[23]。但圖12中明顯可見(jiàn)較多雜峰，推測(cè)應(yīng)該是黑豆異黃酮提取液中的其他異黃酮類單體以及經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附后未被完全吸附掉的一些雜質(zhì)[24]。經(jīng)過(guò)二次純化之后，部分雜峰已經(jīng)去除，剩余峰值推測(cè)為異黃酮類其他單體(圖13)。通過(guò)2次大孔吸附樹(shù)脂純化，使得黑豆異黃酮在提取液中的純度較吸附前有了很大提升。

B1峰為大豆苷，B2峰為染料木苷，B3峰為大豆苷元，B4峰為染料木素B1.Daidzin;B2.Genistin;B3.Isoflavoues aglycone;B4.Genistein圖12 一次純化后黑豆異黃酮提取液的UPLC結(jié)果Fig.12 UPLC chromatograms of black soybean isoflavone after one time purification

C1峰為大豆苷，C2峰為染料木苷，C3峰為大豆苷元，C4峰為染料木素C1.Daidzin;C2.Genistin;C3.Isoflavoues aglycone;C4.Genistein圖13 二次純化后黑豆異黃酮提取液的UPLC結(jié)果Fig.13 UPLC chromatograms of black soybean isoflavone after second time purification

3 結(jié) 論

本研究將超聲波微波輔助提取得到的黑豆異黃酮粗提物，分別經(jīng)NKA-9、AB-8、D101、HPD100、DM301 5種大孔樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn)，結(jié)果表明AB-8樹(shù)脂對(duì)黑豆異黃酮的吸附效果最佳，且最佳吸附時(shí)間為7 h。經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)可知，上樣液質(zhì)量濃度、pH值以及上樣液流速對(duì)黑豆粗黃酮的吸附率均有顯著影響。通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，經(jīng)過(guò)修正得到最佳吸附條件為7.47 mg/mL，pH值為2.27，上樣液流速2 mL/min，通過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)得到最終吸附率為91.029%。AB-8大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)解吸試驗(yàn)表明，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為60%，用量為80 mL時(shí)，黑豆異黃酮的解吸效果最佳。本研究運(yùn)用UPLC方法對(duì)黑豆異黃酮的4種標(biāo)準(zhǔn)品以及經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化的提取物進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果顯示，純化后黑豆異黃酮在提取物中得到了最大限度保留，純度可達(dá)78.56%，回收率為81.66%。表明AB-8大孔吸附樹(shù)脂不僅能夠有效吸附雜質(zhì)，獲得高純度黑豆異黃酮，而且經(jīng)濟(jì)適用，因此可應(yīng)用于黑豆異黃酮的純化研究。

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