miR-29、miR-200a在妊娠期糖尿病者外周血中表達(dá)及臨床意義

倪 雯 劉 佳 張弘雎

1.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院原北陸參謀部門(mén)診部(250002)；2.山東省淄博市婦幼保健院

妊娠期糖尿病(GDM)是臨床產(chǎn)科較為常見(jiàn)的一種妊娠并發(fā)癥，增加不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重危害母嬰健康[1]。發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，臨床診斷需在孕中期檢測(cè)血糖予以判定，若能在早孕期利用相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物預(yù)測(cè)或診斷GDM，將為GDM治療與改善新生兒預(yù)后帶來(lái)裨益。微小RNA(miR)是一類小的非編碼RNA，主要參與mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，其在胎盤(pán)發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、血管生成等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。近年來(lái)，妊娠相關(guān)疾病與外周血中miR表達(dá)失調(diào)的相關(guān)性研究已成為臨床熱點(diǎn)。近期有研究提出[3]，miR-200a可經(jīng)Trp53/Bax信號(hào)通路促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起2型糖尿病，miR-29在血糖誘導(dǎo)的胰島素分泌與胰島素抵抗中發(fā)揮著重要作用，但miR-200a、miR-29與GDM的關(guān)系尚不清楚。為明確miR-29、miR-200a在GDM患者外周血中的表達(dá)特征及臨床意義，本文進(jìn)行對(duì)照研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院產(chǎn)科在2016年5月—2018年5月接診的GDM患者作為觀察組。另選取本院產(chǎn)科同期接診的糖耐量正常孕婦作為對(duì)照組。診斷依據(jù)國(guó)際妊娠與糖尿病研究組織制定的2015妊娠期糖尿病篩查指南[4]：①孕前體質(zhì)指數(shù)(BMI)>24kg/m2；②既往有糖耐量異常史或糖尿病家族史；③既往存在流產(chǎn)、子癇前期、羊水過(guò)多、胎兒畸形、難產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史；④妊娠期間有胎兒過(guò)大、羊水過(guò)多等表現(xiàn)；⑤伴有反復(fù)假絲酵母菌感染；⑥受孕早期有尿糖表現(xiàn)。上述高危孕婦均在早孕期進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)，低危孕婦則在孕24～28周進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)，并結(jié)合空腹血糖、餐后2h血糖指標(biāo)予以判定。2次測(cè)得的空腹血糖均≥7.0mmol/L，或隨機(jī)血糖≥11.1mmol/L，或75g OGTT試驗(yàn)顯示空腹及服糖后1h、2h、3h血糖葡萄糖值中至少有兩項(xiàng)達(dá)到5.3mmol/L、10.0mmol/L、8.6mmol/L、7.8mmol/L即可診斷為妊娠期糖尿病。觀察組患者符合GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組經(jīng)OGTT篩查顯示糖耐量正常。同時(shí)排除年齡<18歲；合并妊娠期高血壓疾??；合并其他內(nèi)科疾??；孕期接觸過(guò)有害物質(zhì)；臍帶或胎盤(pán)異常；母嬰血型不合；多胎妊娠。所有入組對(duì)象均在本院產(chǎn)科住院分娩。

1.2 方法

1.2.1儀器與試劑電化學(xué)發(fā)光法胰島素檢測(cè)儀、全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman公司生產(chǎn))；PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司生產(chǎn))；AM1560 RNA抽提試劑盒(美國(guó)Ambion公司生產(chǎn))；TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)APPS公司)。

1.2.2標(biāo)本采集與檢測(cè)兩組研究對(duì)象均采集空腹靜脈血8ml，分裝于兩支試管中。一支試管使用EDTA抗凝保存，用于提取血清RNA；另一支試管用于檢測(cè)空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)水平。采血后口服葡萄糖液，服糖2h后再次采集靜脈血，用以檢測(cè)2hPG水平。①miR-29、miR-375、miR-200a檢測(cè)：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提血清RNA并放置于-80℃冰箱保存。在16℃、42℃、85℃、4℃環(huán)境下各逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30min、30min、5min、5min，在95℃環(huán)境下行RT-PCR反應(yīng)10min，45個(gè)循環(huán)的95℃反應(yīng)15s，60℃反應(yīng)60s。以U6 SnRNA為內(nèi)參照，使用SDS1.4軟件計(jì)算Ct值，相對(duì)于U6 SnRNA的2-ΔΔCt為目的miRNAs的相對(duì)表達(dá)量。②FINS、FPG檢測(cè)：使用電化學(xué)發(fā)光法胰島素檢測(cè)儀測(cè)定FINS、FPG、2hPG、HbAlc值。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組FINS、FPG、2hPG、HbAlc檢測(cè)值；②對(duì)比兩組的miR-29、miR-375、miR-200a表達(dá)量；③分析外周血miR-29、miR-375、miR-200a表達(dá)與FPG、2hPG、HbAlc、FINS的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般資料

觀察組80例，年齡(28.5±4.4)歲(20～39歲)，分娩孕周(39.3±0.7)周(38～41周)，BMI(23.5±2.4)kg/m2(20～26kg/m2)；對(duì)照組80例，年齡(27.8±3.6)歲(19～40歲)，分娩孕周(39.5±0.2)周(39～42周)，BMI(24.61±3.04)kg/m2(22～27kg/m2)。兩組資料比較無(wú)差異(P>0.05)。

2.2 兩組對(duì)象血糖檢測(cè)比較

觀察組FINS水平低于對(duì)照組，F(xiàn)PG、2hPG、HbAlc水平高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 兩組對(duì)象外周血基因表達(dá)量比較

觀察組外周血miR-29表達(dá)量低于對(duì)照組， miR-375、miR-200a表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 兩組血糖檢測(cè)結(jié)果比較

表2 兩組外周血基因表達(dá)量比較

2.4 外周血基因表達(dá)與血糖指標(biāo)相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，miR-29表達(dá)的ΔCt值與FPG、2hPG、HbAlc均呈正相關(guān)，與FINS呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；miR-375、miR-200a表達(dá)的ΔCt值均與FPG、2hPG、HbAlc呈負(fù)相關(guān)，與FINS呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 外周血miR-29、miR-375、miR-200a表達(dá)與血糖指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

目前，臨床已有多種GDM預(yù)防手段，但總體效果并不滿意，多數(shù)GDM患者都是在孕中期才被發(fā)現(xiàn)，少數(shù)患者確診時(shí)甚至已處于孕晚期。GDM發(fā)現(xiàn)得越晚，對(duì)孕產(chǎn)婦及圍生兒的危害越大，而早期診斷GDM能夠盡早采取干預(yù)措施，穩(wěn)定地控制血糖，對(duì)于改善母嬰預(yù)后具有重要作用。

目前已有研究證實(shí)在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中均有miRNA的參與，如自身免疫疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、2型糖尿病、腫瘤等，故臨床可將外周血中的miRNA作為預(yù)測(cè)相關(guān)疾病的生物學(xué)標(biāo)志物[5]。近期有文獻(xiàn)報(bào)道[6]，在GDM的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中均有miRNA的參與。miRNA在人體細(xì)胞、組織的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，高糖、高脂環(huán)境會(huì)對(duì)miRNA表達(dá)產(chǎn)生影響，所以miRNA表達(dá)異?？稍谝欢ǔ潭壬戏从硻C(jī)體的高糖、高脂狀態(tài)。人類血清中的miRNA種類繁多，不同的miRNA都具有較高的疾病特異性與穩(wěn)定性，將其作為預(yù)測(cè)各種疾病預(yù)后的標(biāo)志物有較高的可靠性。

近期有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與胰島素的生成、分泌、作用以及胰島發(fā)育均有著密切聯(lián)系。miRNA在人體血液、血清中有高度的穩(wěn)定性， miRNA檢測(cè)具有準(zhǔn)確、微創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，所以越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為可將其作為糖尿病發(fā)病機(jī)制的靶點(diǎn)與診斷標(biāo)志。miR-375主要由胰島β細(xì)胞表達(dá)，其能通過(guò)控制肌營(yíng)養(yǎng)素水平來(lái)調(diào)節(jié)胰島素分泌。miR-29在血糖刺激的胰島素分泌與胰島素抵抗中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚7]顯示自發(fā)性糖尿病大鼠的miR-29表達(dá)水平顯著高于正常大鼠，而在自發(fā)性糖尿病大鼠的脂肪組織3T3-L1細(xì)胞系中檢測(cè)到了過(guò)表達(dá)的miR-29。miR-29的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制胰島素激發(fā)的葡萄糖攝取能力，降低細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，其與高胰島素、高血糖引起的胰島素失敏原理基本相同。據(jù)一項(xiàng)文獻(xiàn)報(bào)道顯示[8]，16～19孕周的GDM患者外周血miR-132、miR-222、miR-29a表達(dá)均顯著低于正常孕婦，提示miRNA可作為評(píng)估GDM的無(wú)創(chuàng)血清學(xué)標(biāo)記物。

本次研究結(jié)果顯示，觀察組的FINS水平顯著低于對(duì)照組，F(xiàn)PG、2hPG、HbAlc水平顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明GDM的發(fā)生與β細(xì)胞功能下降導(dǎo)致的胰島素分泌減少有關(guān)。觀察組外周血miR-29表達(dá)量顯著低于對(duì)照組， miR-375表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。這一結(jié)果與前述兩篇?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)研究結(jié)論相符，說(shuō)明miR-375可調(diào)低PDK1表達(dá)，影響葡萄糖對(duì)胰島素基因表達(dá)的刺激能力，影響DNA合成，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重糖尿病。miR-375的高表達(dá)可促使胰島β細(xì)胞凋亡，miR-29的低表達(dá)則能通過(guò)抑制胰島β細(xì)胞分化、成熟來(lái)破壞胰島素分泌功能。在miR-29與miR-375表達(dá)異常的共同作用下，使胰島β細(xì)胞數(shù)量明顯減少，削弱胰島β細(xì)胞功能，進(jìn)而引發(fā)GDM。miR-200是miRNA家族的重要成員，miR-200a是miR-200家族的成員之一，近年來(lái)關(guān)于miR-200a表達(dá)與糖尿病相關(guān)性的研究越來(lái)越多。國(guó)內(nèi)有研究顯示，與正常孕婦相比，GDM患者胎盤(pán)及外周血中的miR-200a表達(dá)均明顯增加，且胎盤(pán)與外周血中的miR-200a表達(dá)水平接近。但也有研究顯示，16例孕16～19周GDM患者外周血中的miR-200a表達(dá)與正常孕婦接近。本次研究結(jié)果顯示，觀察組外周血中的miR-200a表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，與前述研究結(jié)論不符，可能是因?yàn)榍笆鲅芯窟x取的GDM樣本含量較小和檢測(cè)時(shí)間較早，而本次檢測(cè)時(shí)間多為孕晚期，提示miR-200a表達(dá)的升高在孕晚期表現(xiàn)更為明顯。本文相關(guān)性分析顯示，miR-29、miR-375、miR-200a表達(dá)的ΔCt值與FPG、2hPG、HbAlc、FINS均顯著相關(guān)，說(shuō)明miR-29、miR-375、miR-200a異常表達(dá)均與GDM易感性密切相關(guān)。

綜上所述，外周血中miR-29、miR-200a、miR-375表達(dá)均血糖相關(guān)指標(biāo)密切相關(guān)，miR-29、miR-200a、miR-375表達(dá)異常預(yù)示著GDM易感性。臨床可通過(guò)測(cè)定孕婦外周血miR-29、miR-375表達(dá)為臨床早期診斷GDM提供一定的參考依據(jù)，而miR-200a可能在孕晚期增加明顯，其對(duì)早期GDM的預(yù)測(cè)價(jià)值還有待進(jìn)一步考證。