六氯苯脅迫下2種濕地植物根際土壤微生物數(shù)量與酶活性變化

張翠萍，李淑英，王 蓓,2，盧國(guó)理，朱春蓉，周元清①

(1.玉溪師范學(xué)院污染控制與生態(tài)修復(fù)研究中心，云南 玉溪 653100；2.云南大學(xué)生態(tài)學(xué)與地植物學(xué)研究所，云南 昆明 650091)

近年來,持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants,POPs)六氯苯(hexachlorobenzene,HCB)對(duì)人體和環(huán)境的潛在危害已成為世界各國(guó)關(guān)注的焦點(diǎn)[1-2]。自然環(huán)境和生物體都不同程度地受到HCB污染,且HCB廣泛分布于水體、土壤和沉積物等環(huán)境介質(zhì)中,可滯留數(shù)年甚至數(shù)十年或更長(zhǎng)時(shí)間[3-6]。由于HCB具有強(qiáng)親脂性,使得土壤和沉積物成為HCB聚集的主要場(chǎng)所。目前,生物吸附與生物降解成為解決HCB污染問題最有潛力的方法之一[7]。

人工濕地技術(shù)已廣泛應(yīng)用于POPs或農(nóng)藥環(huán)境污染物的去除[8-9]。植物作為人工濕地系統(tǒng)的重要組成部分,其根系輸氧作用和根系分泌物直接影響根際微生物及土壤酶(脲酶、脫氫酶和過氧化氫酶等)活性。ZHOU等[10-11]研究指出,人工濕地植物根際效應(yīng)對(duì)HCB降解的影響是修復(fù)HCB污染環(huán)境的主要切入點(diǎn)。土壤酶和土壤微生物是衡量土壤生態(tài)效應(yīng)的重要指標(biāo),兩者共同推動(dòng)土壤的新陳代謝過程,進(jìn)而影響濕地污染物的降解和轉(zhuǎn)化[12]。根際微生物作為濕地污染物凈化及降解的主要執(zhí)行者[13],其種類和數(shù)量直接影響污染土壤的生物化學(xué)活性與轉(zhuǎn)化[14]。土壤酶是土壤生物化學(xué)反應(yīng)的催化劑[15],參與濕地土壤中許多重要的代謝過程,其活性大小能直接反映污染物降解的強(qiáng)度和方向,是評(píng)價(jià)土壤自凈能力的一個(gè)重要指標(biāo)。因此,探討濕地植物根際土壤微生物數(shù)量和酶活性對(duì)HCB降解的影響,對(duì)于研究POPs生物降解機(jī)理及根際效應(yīng)具有重大意義。目前,關(guān)于土壤酶和土壤微生物的研究較多,但人工濕地的根際生物學(xué)研究還相對(duì)薄弱,尤其是針對(duì)人工濕地POPs生物降解的根際生態(tài)研究亟待開展。

以蘆葦(Phragmitesaustralis)和香蒲(Typhaangustifolia)為人工濕地典型植物,構(gòu)建濕地微宇宙系統(tǒng),研究HCB脅迫下根際和非根際土壤的微生物數(shù)量、酶活性和HCB變化特征,以期初步探明蘆葦和香蒲2種挺水植物根際與非根際土壤微生物數(shù)量和酶活性差異對(duì)HCB生物降解的影響,旨在闡明HCB脅迫下濕地土壤微生物數(shù)量和酶活性的變化規(guī)律,同時(shí)為闡明HCB生物降解機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)裝置

參照ZHOU等[10]的方法,選擇蘆葦和香蒲為人工濕地典型植物,構(gòu)建人工濕地微宇宙根箱(圖1)。根箱大小為40 cm×30 cm×50 cm(長(zhǎng)×寬×高),自上而下依次是10 cm厚水層〔用自來水補(bǔ)充其蒸發(fā)量,使水層保持在(10±1) cm〕、30 cm厚土壤層和10 cm厚礫石層。如圖1所示,用48 μm孔徑尼龍網(wǎng)將系統(tǒng)橫向分成濕地植物根際生長(zhǎng)區(qū)和2個(gè)非根際區(qū),植物根系被限制于中室內(nèi)生長(zhǎng)。

1.1.2 供試植物與土壤

蘆葦、香蒲及底泥均取自撫仙湖流域內(nèi)的牛摩濕地。選擇20～40 cm高的蘆葦和香蒲均一苗植株。供試底泥理化指標(biāo)如下:pH值為8.13,w(有機(jī)質(zhì))為21.16 g·kg-1,w(TN)為9.27 g·kg-1,w(TP)為2.15 g·kg-1,質(zhì)量含水率為17.6%。將2 000 mg HCB(分析純,純度w為99.50%)溶于4 000 mL正己烷中,將溶液添加到1 500 g石英砂中,充分混勻至溶劑完全揮發(fā),將石英砂加入到1 000 kg底泥中,每個(gè)箱子裝入65 kg底泥,獲得2.0 mg·kg-1HCB污染底泥[10,16],充分混合后高壓蒸汽滅菌,將污染底泥轉(zhuǎn)移到濕地微宇宙系統(tǒng)中。在初始w(HCB)為1.21 mg·kg-1條件下,設(shè)置未滅菌蘆葦、滅菌蘆葦、未滅菌香蒲、滅菌香蒲和無植物種植的對(duì)照(CK)共5個(gè)處理,每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。其中,滅菌植株用表面消毒方法(經(jīng)w=70%的酒精清洗1 min后,用w=5%的NaClO消毒5 min,再用無菌水清洗3次)獲取。試驗(yàn)處理組均經(jīng)歷第1～4周7 d淹水(water flooding,WF)和7 d排水(water draining,WD)的交替培養(yǎng)、第5～12周淹水(WF)和第13周排水(WD)的過程。試驗(yàn)期間所有處理組在整個(gè)生長(zhǎng)期均放置于室外遮雨棚下。

圖1 蘆葦和香蒲人工濕地微宇宙系統(tǒng) Fig.1 Constructed wetland mesocosms vegetated with P. australis or T. angustifolia

1.2 樣品采集與分析方法

HCB脅迫下濕地植物緩培4 d后,于第1(WF)、2(WD)、3(WF)、4(WD)、12(WF)、13(WD)周的第6天采集底泥(5—12周為淹水狀態(tài))。采用ZHAO等[14]自制的底泥采樣器,對(duì)濕地微宇宙系統(tǒng)中的根際與非根際區(qū)域土壤進(jìn)行多點(diǎn)梅花采樣,分別獲得根際土與非根際土,每個(gè)土樣至少獲取150 g混合土樣裝入密封袋中待測(cè)。采用氣相色譜儀定量測(cè)定土壤中HCB含量[17],同時(shí)稱取20.0 g土壤樣品，加入0.1 mL質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1的HCB標(biāo)液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，3次加標(biāo)回收率分別為86.4%、91.7%和90.3%。HCB降解率(R,%)計(jì)算公式為R=(Ci-Cn)/Ci×100%。其中,Ci為HCB初始含量平均值,mg·kg-1;Cn為第n天HCB含量,mg·kg-1。

土壤pH值、全氮含量、全磷含量、有機(jī)質(zhì)含量和含水率均按土壤農(nóng)化常規(guī)分析方法[18]測(cè)定。參照文獻(xiàn)[19],細(xì)菌選用LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)(35 ℃),真菌采用虎紅培養(yǎng)基培養(yǎng)(28 ℃),放線菌采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)(28 ℃),菌種分離和計(jì)數(shù)采用平板稀釋法。將涂好平板的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。土壤脫氫酶(DEH)活性采用氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法測(cè)定;過氧化氫酶(CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定,以單位質(zhì)量土壤消耗的0.002 mol·L-1KMnO4體積表示;多酚氧化酶(PPO)活性采用紫外光譜比色法(乙醚溶解紅紫棓精)測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),不同處理結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示,采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA),采用Origin 8.0軟件作圖。所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物數(shù)量變化特征

細(xì)菌在污水凈化過程中起重要作用,可使復(fù)雜有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為可供植物和微生物利用的無機(jī)化合物。HCB脅迫下蘆葦和香蒲組濕地土壤3類微生物數(shù)量由多到少依次為細(xì)菌、放線菌和真菌(表1),細(xì)菌數(shù)量在3類微生物中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),約占3類微生物總量的98%。根際土與非根際土中微生物數(shù)量均表現(xiàn)為未滅菌植物>滅菌植物(P< 0.05)。蘆葦根際土和非根際土中微生物數(shù)量分別為95.24×105和16.33×105g-1,香蒲根際土和非根際土中微生物數(shù)量分別為35.13×106和15.25×106g-1,蘆葦和香蒲組均表現(xiàn)出明顯的根際效應(yīng)(根際土與非根際土細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量之比均大于1,即R/S>1),根際土中細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量均明顯大于非根際土(P< 0.05),且香蒲組濕地土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量基本上多于蘆葦組,表明不同植物的根際效應(yīng)有差異。

表1 蘆葦和香蒲根際土壤微生物數(shù)量

Table 1 Microbial population inP.australisandT.angustifoliarhizosphere soil

植物處理樣品細(xì)菌數(shù)量/105g-1真菌數(shù)量/102g-1放線菌數(shù)量/103g-1微生物總數(shù)/105g-1CK30.00±1.1612.78±1.2323.28±0.2830.23±1.40蘆葦(P.australis)未滅菌根際土60.00±2.1450.28±2.3172.78±1.2460.78±2.30非根際土9.58±3.2036.31±5.3235.06±0.239.98±2.87R/S6.261.382.07—滅菌根際土34.00±4.1211.10±5.2044.80±6.0734.46±4.05非根際土6.15±3.216.89±2.1318.60±0.346.35±3.76R/S5.531.612.41—香蒲(T.angustifolia)未滅菌根際土219.40±2.1330.91±1.31114.20±2.13220.56±2.01非根際土99.80±4.2320.41±1.0231.76±0.54100.15±3.89R/S1.301.323.20—滅菌根際土129.70±1.2540.72±5.32101.60±5.21130.76±1.03非根際土52.23±6.026.52±0.7824.14±0.2452.37±5.09R/S4.203.134.73—

土壤質(zhì)量以干土計(jì)。細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量以菌落形成單位(colony-forming units,CFU)計(jì)。R/S指根際土與非根際土某類微生物數(shù)量之比?！啊北硎緹o數(shù)據(jù)。

2.2 酶活性變化特征

不同污染環(huán)境下不同植物間土壤酶活性存在一定差異。由圖2可知,蘆葦和香蒲組土壤PPO、DEH、CAT活性均顯著高于CK組,植物根際土壤DEH、CAT和PPO活性均顯著高于非根際土(P< 0.05),蘆葦和香蒲表現(xiàn)出明顯的根際效應(yīng),說明蘆葦和香蒲能通過改變根際酶活性來適應(yīng)HCB污染環(huán)境。香蒲組土壤酶活性平均值均高于蘆葦組,但差異不顯著。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi),未滅菌植物與滅菌植物3種酶活性變化趨勢(shì)一致,蘆葦和香蒲組根際土與非根際土壤中3種酶活性均表現(xiàn)為未滅菌>滅菌,表明微生物數(shù)量與酶活性變化密切相關(guān)。

圖2 蘆葦和香蒲根際與非根際土壤酶活性變化 Fig.2 Variations of enzyme activities in rhizosphere and non-rhizosphere soils

2.3 HCB濃度變化特征

表2顯示，在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi),人工濕地蘆葦和香蒲組土壤中HCB降解率均明顯高于CK組,說明蘆葦和香蒲均促進(jìn)HCB的降解,且香蒲對(duì)HCB的降解效能比蘆葦強(qiáng)。由于植物生長(zhǎng)緩慢,試驗(yàn)3～4周時(shí)植物處理組降解率大多高于CK組,僅部分香蒲和蘆葦非根際土對(duì)HCB的降解率低于CK組。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi),香蒲和蘆葦組根際土壤中HCB含量顯著低于非根際土(P< 0.05),說明蘆葦和香蒲的根際效應(yīng)明顯。1～13周時(shí)蘆葦和香蒲組根際土與非根際土中HCB降解率均表現(xiàn)為未滅菌>滅菌,說明微生物可能參與了HCB的生物降解。

表2 蘆葦和香蒲濕地土壤中HCB含量變化

Table 2 Variations of HCB concentrations inP.australisandT.angustifoliawetland soil

植物處理樣品不同時(shí)間w(HCB)/(mg·kg-1)1d6d13d20d27d83d90d總降解率/%CK1.01±0.051A0.98±0.041A0.93±0.012B0.87±0.013C0.84±0.012C0.74±0.012D0.72±0.020D29蘆葦未滅菌根際土0.95±0.038Ac0.84±0.032Bc0.80±0.012Bc0.73±0.013Cc0.70±0.013Cc0.56±0.013Dc0.52±0.010Dc45(P.australis)非根際土1.05±0.013Ab1.02±0.014Bb0.93±0.023Cb0.89±0.016Cb0.81±0.012Db0.71±0.013Eb0.68±0.020Eb35滅菌根際土1.08±0.012Ab1.01±0.011Bb0.97±0.016Ba0.88±0.023Cb0.83±0.023Da0.70±0.021Eb0.66±0.020Eb39非根際土1.11±0.022Aa1.09±0.014Aa1.00±0.013Ba0.96±0.019Ba0.89±0.016Ca0.76±0.016Da0.72±0.014Da35香蒲未滅菌根際土1.13±0.043Ac0.91±0.021Bc0.86±0.014Bc0.73±0.031Cd0.68±0.023Cc0.53±0.023Dc0.50±0.010Dc56(T.angustifolia)非根際土1.16±0.022Ab1.09±0.014Ba1.01±0.022Cb0.90±0.015Cc0.87±0.022Db0.76±0.110Eb0.72±0.010Eb38滅菌根際土1.16±0.012Ab1.10±0.015Ba1.01±0.016Cb0.95±0.012Cb0.89±0.012Db0.79±0.023Eb0.73±0.010Eb37非根際土1.20±0.022Aa1.15±0.010Aa1.07±0.014Ba1.03±0.012Ba0.95±0.081Ca0.83±0.019Da0.80±0.120Da33

同一行數(shù)據(jù)后英文大寫字母不同表示不同降解時(shí)間之間土壤中HCB含量差異顯著,同一列數(shù)據(jù)后英文小寫字母不同表示不同處理植物組土壤中HCB含量差異顯著。

2.4 酶活性、微生物數(shù)量和HCB含量的相關(guān)性

表3～4顯示,蘆葦和香蒲組濕地土壤細(xì)菌數(shù)量、真菌數(shù)量和放線菌數(shù)量間呈正相關(guān)關(guān)系,且放線菌數(shù)量與細(xì)菌數(shù)量、真菌數(shù)量間達(dá)顯著水平(P<0.05),表明3類土壤微生物間存在密切聯(lián)系,就3種土壤酶活性而言,PPO活性與DEH活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與CAT活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),DEH活性與CAT活性間相關(guān)不顯著,說明在HCB脅迫下,土壤CAT活性和PPO活性與土壤生化過程聯(lián)系更密切。HCB含量與蘆葦、香蒲組土壤酶活性和微生物數(shù)量之間總體呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì),且香蒲組HCB含量分別與DEH活性(r=-0.418)和PPO活性(r=-0.443)之間相關(guān)顯著(P<0.05),說明土壤DEH活性和PPO活性可能改善了根際環(huán)境,促進(jìn)濕地土壤中HCB的生物降解,同時(shí),HCB脅迫可能抑制土壤酶活性和微生物數(shù)量。

表3 蘆葦組土壤中酶活性、微生物數(shù)量和HCB含量的相關(guān)系數(shù)

Table 3 Correlation coefficient of enzyme activities and microbial population quantities with HCB concentration in the soil planted withP.australis

指標(biāo)細(xì)菌數(shù)量真菌數(shù)量放線菌數(shù)量DEH活性CAT活性PPO活性w(HCB)-0.005-0.014-0.040-0.271-0.066-0.221細(xì)菌數(shù)量0.0190.758**0.0100.2360.052真菌數(shù)量0.0710.0120.192-0.123放線菌數(shù)量-0.0110.2770.035DEH活性0.1480.323*CAT活性0.851**

*表示相關(guān)顯著(P< 0.05);**表示相關(guān)極顯著(P< 0.01)。

表4 香蒲組土壤中酶活性、微生物數(shù)量和HCB含量的相關(guān)系數(shù)

Table 4 Correlation coefficients of enzyme activities and microbial population with HCB concentration in the soil planted withT.angustifolia

指標(biāo)細(xì)菌數(shù)量真菌數(shù)量放線菌數(shù)量DEH活性CAT活性PPO活性w(HCB)-0.108-0.221-0.210-0.418*-0.273-0.443*細(xì)菌數(shù)量0.2040.665**-0.0230.030-0.095真菌數(shù)量0.530**0.1040.0340.011放線菌數(shù)量-0.0060.154-0.083DEH活性0.0790.253*CAT活性0.875**

*表示相關(guān)顯著(P< 0.05);**表示相關(guān)極顯著(P< 0.01)。

3 討論

3.1 蘆葦和香蒲根際微生物數(shù)量和酶活性對(duì)HCB降解能力的差異

根際環(huán)境和根際微生物是植物降解毒性有機(jī)污染物的基礎(chǔ),根系分泌物主動(dòng)營(yíng)造的根際微域環(huán)境是有機(jī)污染物得以快速降解的重要因素[20]。筆者研究了HCB脅迫下蘆葦和香蒲濕地土壤微生物數(shù)量與酶活性特征。結(jié)果表明,蘆葦和香蒲根際微生物數(shù)量顯著高于非根際土。這主要是由于植物根系分泌物富含各種無機(jī)離子、低分子量糖、多種氨基酸和有機(jī)酸,為植物根際土壤微生物提供了豐富的碳源和能源。筆者研究結(jié)果也顯示,在HCB脅迫下,蘆葦和香蒲濕地根際土中DEH、CAT和PPO活性均高于非根際土,表現(xiàn)出顯著的根際效應(yīng)(R/S>1)。一方面，這是因?yàn)橹参锔捣置诟鞣N酶類釋放到根際區(qū),另一方面,則是植物根際相對(duì)較高的微生物數(shù)量及生理代謝作用的結(jié)果。筆者研究中,在HCB脅迫下,CAT具有解毒和抗逆功能,其活性升高能有效防止土壤新陳代謝過程中過氧化氫對(duì)生物體的毒害[21]。

植物對(duì)環(huán)境中污染物質(zhì)的吸收具有廣泛性,不同植物對(duì)不同污染物質(zhì)的吸收能力不同[22]。筆者試驗(yàn)中香蒲濕地土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量及土壤DEH、CAT、PPO活性均顯著高于蘆葦(P<0.05),這是因?yàn)橄闫迅狄话惚忍J葦根系更發(fā)達(dá)密集,根系環(huán)境更穩(wěn)定[23]。此外,不同微生物類群利用植物根系分泌物的種類不同,則不同植物對(duì)根際微生物類群的生長(zhǎng)刺激也不同。因此,對(duì)于不同生態(tài)型和基因型植物,根際土壤微生物數(shù)量和酶活性差異很大,對(duì)污染物的去除效果也不同。這主要是因?yàn)橥寥牢⑸锏纳锒鄻有詻Q定了其功能的多樣性,而土壤微生物作為媒介,由其生成和釋放的酶催化的諸多生物化學(xué)過程是土壤功能多樣性的前提和基礎(chǔ)。筆者研究中,蘆葦和香蒲根際土壤微生物數(shù)量和酶活性顯著高于CK(P<0.01),此與蘇嘉欣等[24]的研究結(jié)果一致。

3.2 蘆葦和香蒲根際土壤微生物數(shù)量和酶活性對(duì)HCB降解的響應(yīng)

微生物是人工濕地中污染物去除的主要執(zhí)行者。大量研究表明,人工濕地中微生物主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌[25],這些不同特性的微生物能對(duì)污染環(huán)境的變化做出直接而快速的反應(yīng)[26-28]。ZHANG等[29]研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌是濕地土壤中HCB降解的“主力菌”,筆者研究中,蘆葦和香蒲組土壤中HCB降解率在33%～56%之間,細(xì)菌數(shù)量占濕地土壤3類微生物總量的98%,濕地植物土壤微生物數(shù)量和酶活性與HCB含量呈負(fù)相關(guān),說明蘆葦和香蒲濕地土壤微生物數(shù)量和酶活性的增加有利于促進(jìn)HCB的降解。土壤酶是影響土壤微生態(tài)環(huán)境的重要因素,參與生物化學(xué)過程和養(yǎng)分循環(huán),土壤微生物數(shù)量與酶活性間存在密切聯(lián)系。筆者研究中土壤微生物數(shù)量和酶活性之間相關(guān)性不顯著,可能與土壤酶活性的影響因素非常復(fù)雜,土壤中微生物種類、水氣熱狀況、酸堿度、結(jié)構(gòu)組成、養(yǎng)分豐缺、污染程度及培肥方式等都顯著影響土壤酶活性有關(guān);此外,還可能與微生物的測(cè)定方法有關(guān),目前可分離培養(yǎng)的微生物數(shù)量?jī)H占微生物總數(shù)的1%～5%。蘆葦和香蒲處理組HCB含量與土壤酶活性和微生物數(shù)量大致呈負(fù)相關(guān),其中,香蒲組HCB含量分別與DEH活性和PPO活性之間相關(guān)顯著(P<0.05),表明土壤DEH和PPO在HCB降解過程中起促進(jìn)作用。人工濕地主要通過植被截流、過濾以及微生物新陳代謝等活動(dòng)凈化水質(zhì)[30-31],濕地污染物的降解和轉(zhuǎn)化主要由微生物活動(dòng)完成[32],土壤酶活性和微生物數(shù)量對(duì)植被-土壤生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)質(zhì)的分解、養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)等過程發(fā)揮著重要作用[33]。

4 結(jié)論

(1)在HCB 脅迫下,人工濕地中不同植物根際微生物數(shù)量及DEH、CAT、PPO活性存在顯著差異,香蒲組土壤微生物數(shù)量約是蘆葦組的6倍,香蒲組土壤酶活性顯著高于蘆葦組(P<0.05)。

(2)蘆葦和香蒲具有明顯的根際效應(yīng)(R/S>1),土壤微生物數(shù)量和酶活性均表現(xiàn)為根際土大于非根際土。

(3)HCB含量與蘆葦、香蒲根際微生物數(shù)量和酶活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,香蒲組HCB含量分別與DEH活性和PPO活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),說明土壤DEH和PPO可能促進(jìn)了濕地土壤中HCB 的生物降解,同時(shí),HCB脅迫對(duì)土壤酶活性和微生物數(shù)量起抑制作用。

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