花粉源大小及花粉競爭對抗病毒轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移的影響

董姍姍，石 雪,2，于賜剛，張振華，陳 明，劉 燕①

(1.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所/ 環(huán)境保護生物安全重點實驗室，江蘇 南京 210042；2. 南京信息工程大學農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境系，江蘇 南京 210044；3.中國農(nóng)業(yè)科學研究院作物科學研究所，北京 100081)

小麥黃花葉病是危害我國小麥生產(chǎn)的主要土傳病毒病之一,主要由小麥黃花葉病毒(wheat yellow mosaic virus,WYMV)所引起,以禾谷多黏菌(polymyxa graminis)為傳播媒介。小麥感病后,一般可造成減產(chǎn)10%～30%,病害嚴重的田塊可減產(chǎn)50%[1-3]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為提高小麥抗病性、增加產(chǎn)量開辟了新途徑[4]。隨著抗病轉(zhuǎn)基因小麥的快速發(fā)展,其環(huán)境釋放可能產(chǎn)生的生物安全問題受到了廣泛關(guān)注,特別是其外源基因漂移的潛在生態(tài)風險[5-7]。

小麥是以自花授粉為主的風媒作物,花粉是小麥轉(zhuǎn)基因漂移的主要媒介。在前期研究中發(fā)現(xiàn)抗病轉(zhuǎn)基因小麥的基因漂移頻率與花粉密度之間存在明顯的相關(guān)性[8]。而且花粉流的規(guī)模效應即花粉源大小可以在一定范圍內(nèi)影響小麥花粉密度的衰變速率[9]?；ǚ墼创笮〉淖兓部赡軙е滦←溵D(zhuǎn)基因漂移產(chǎn)生類似的效應,即基因漂移的頻率和最遠距離隨花粉源面積的增大而增加。HUCL等[10]和MATUS-CDIZ等[11-12]以藍色胚乳小麥作為花粉供體,將花粉源面積設(shè)置為5 m×5 m時檢測到的平均最大基因漂移頻率為1.75%,最遠漂移距離為27 m;當花粉源面積增加到50 m×50 m時,基因漂移的最遠距離達300 m,漂移頻率為0.005%;再將花粉源面積增加到33 hm2時,在距花粉源2.75 km處仍能檢測到0.01%的基因漂移頻率。但這些研究是在不同年份和不同地點進行的,試驗的氣候條件、地理位置、試驗方法以及材料品種都會對小麥的基因漂移頻率產(chǎn)生一定影響[13-14]。因此,有必要在相同氣候條件下研究花粉源面積大小對小麥基因漂移距離以及變化規(guī)律的影響。另外,在小麥花粉介導的基因漂移研究中,受體材料的異交率也是影響基因漂移頻率的重要因素。LOUREIRO等[15]以去雄小麥為花粉受體,通過連續(xù)3 a的田間試驗調(diào)查了2種栽培小麥(Triticumaestivum)以及栽培小麥與硬粒小麥(Triticumturgidumvar.durum)之間的最大異交率,結(jié)果顯示,距花粉源0 m處栽培小麥之間的基因漂移頻率為37%～56%,栽培小麥到硬粒小麥的基因漂移頻率為5%～30%。在以未去雄的常規(guī)栽培小麥作為花粉受體時,距花粉源0 m處檢測到的平均漂移頻率僅為0.183%[16]。由以上研究可知,去雄小麥由于缺少自身花粉的競爭只能接受外來花粉,其近距離處供體材料的花粉密度直接決定了異交率,自花授粉競爭可能是導致栽培小麥品種間極低的異交率以及基因漂移頻率的主要原因之一。

以我國自主研發(fā)培育的抗小麥黃花葉病毒(WYMV)轉(zhuǎn)基因小麥品種N12-1為花粉供體,以揚麥158和矮桿敗育小麥為花粉受體,通過可控的田間栽培試驗,調(diào)查不同花粉源面積以及花粉受體材料中轉(zhuǎn)基因小麥的基因漂移頻率,分析花粉源大小及花粉競爭對轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以無選擇標記抗WYMV轉(zhuǎn)基因小麥N12-1為花粉供體。該材料采用基因槍共轉(zhuǎn)化法獲得:首先從小麥黃花葉病毒揚州株系RNA1中獲得復制酶基因WYMV-Nib8,該基因長度為1 212 bp,位置在RNA1序列的5 284～6 495 bp之間;然后采用基因槍共轉(zhuǎn)化法將該基因連同篩選標記bar基因?qū)霌P麥158,獲得4個高抗WYMV的小麥轉(zhuǎn)基因株系N12、N13、N14和N15;最后利用PCR技術(shù)和Basta涂抹法,在轉(zhuǎn)基因株系N12的T3代中篩選到只含有Nib8基因而無選擇標記bar基因的轉(zhuǎn)基因小麥株系N12-1[17]。該供體材料由中國農(nóng)業(yè)科學院作物研究所提供。

為比較分析花粉競爭對小麥轉(zhuǎn)基因漂移頻率的影響,采用2種花粉受體材料:一種是轉(zhuǎn)基因小麥N12-1的非轉(zhuǎn)基因近等基因系揚麥158(YM),該材料是常規(guī)小麥栽培品種,自交可育,由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所提供;另一種為矮桿敗育小麥(DW),是具有矮稈基因標記的太谷核雄性不育小麥。在矮敗小麥的后代群體中,有一半矮稈不育株和一半非矮稈可育株,該材料由徐州市農(nóng)業(yè)科學院提供[18]。

1.2 試驗設(shè)計

于2014年11月—2015年6月在江蘇省南京市江寧區(qū)橫溪鎮(zhèn)南京蔬菜花卉科學研究所(31°43′ N,118°46′ E)采取2×2的析因試驗設(shè)計,共4個試驗處理(圖1)。設(shè)置2種不同面積的花粉源:面積100和 400 m2(圖1)。種植2種花粉受體材料:揚麥158和矮敗小麥。4個處理(100-YM、100-DW、400-YM和400-DW)小區(qū)平行排列,小區(qū)之間間隔20 m以上的空地,小麥盛花期前在小區(qū)間設(shè)置長100 m、高1.5 m的隔離欄,上附塑料布以防止試驗處理間相互影響。

小麥采取直播方式,播種行距為20 cm。為了保證花粉供體與受體花期相遇,供體材料N12-1和受體揚麥158于2014年11月1日播種,矮敗小麥于2014年11月20日播種。試驗過程中按照當?shù)剞r(nóng)田管理措施進行田間管理,嚴格按照《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》等法規(guī)、規(guī)章要求開展試驗,且試驗基地已獲得農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室的批復(農(nóng)基安辦報告字2014-447號)。

深灰色正方形區(qū)域代表種植花粉供體轉(zhuǎn)基因小麥N12-1;白色矩形區(qū)域代表 種植花粉受體揚麥158;淺灰色矩形區(qū)域代表種植花粉受體矮敗小麥。 100-YM:花粉源面積100 m2,花粉受體揚麥158;400-YM:花粉源面積400 m2,花粉受體揚麥158;100-DW:花粉源面積100 m2,花粉受體矮敗小麥;400-DW:花粉源面積400 m2,花粉受體矮敗小麥。 箭頭方向為轉(zhuǎn)基因小麥盛花期間主導風向。

1.3 試驗方法

1.3.1 取樣方法

于種子成熟期在每個非轉(zhuǎn)基小麥田塊中平行設(shè)置10個取樣行,分別距花粉源0、1、2、3、5、10、20、30、50和80 m,每行隨機收獲約60個麥穗,再將收獲的麥穗隨機分成3份,即設(shè)置3個重復,每個重復的小麥種子烘干脫粒后萌發(fā),用于轉(zhuǎn)基因漂移頻率的檢測。

1.3.2 檢測方法

小麥種子置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中萌發(fā),大約15 d后取10 cm左右高的小麥嫩葉,采用GMO作物提取試劑盒〔KG202,天根生化科技(北京)有限公司〕提取小麥基因組總DNA。共提取揚麥158基因組DNA 10 000份,矮敗小麥基因組DNA 6 000份。利用分光光度計(Nano Drop 2000,Thermo Scientific)測定所提取DNA的濃度和純度,根據(jù)檢測的濃度將DNA 樣品稀釋到50～100 ng·μL-1,然后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＿x用特異性引物對插入的目的基因Nib8進行PCR定性檢測,該引物上下游分別為5′-G-C-G-A-C-A-A-A-C-C-T-G-A-A-A-G-C-C-C-C-A-C-A-C-3′ 和5-A-A-C-G-C-C-G-C-C-C-T-T-C-TTAGCCCACT-3′[8]。20 μL的PCR反應體系中含有緩沖液10 μL,上下游引物(10 μmol·L-1) 各0.6 μL,DNA 模板0.6 μL,DNA聚合酶0.4 μL,無菌水7.8 μL。PCR反應程序如下:預變性94 ℃ 5 min,變性94 ℃ 30 s，退火65 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s,共35個循環(huán),循環(huán)結(jié)束后總延伸72 ℃ 10 min,16 ℃條件下保存。PCR產(chǎn)物采用w為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,目的基因Nib8的擴增片段長度為593 bp。出現(xiàn)目的條帶的樣本記為陽性結(jié)果,其余樣本記為陰性結(jié)果(圖2)。

圖中M代表DL1000 marker;第1泳道為陰性對照;第2泳道為 陽性對照;第3～7泳道為陰性樣本;第8泳道為陽性樣本。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)檢測到的陽性樣本數(shù),小麥的轉(zhuǎn)基因漂移頻率的計算公式:小麥的轉(zhuǎn)基因漂移頻率=(陽性樣本個數(shù)/總檢測樣本數(shù))×100%。采用一般線性模型中的單因變量多因素方差(General Linear Model-Univariate)分析花粉源面積、受體材料、花粉源距離以及交互作用對轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移頻率的影響,顯著性檢測水平為0.05。采用獨立樣本t檢驗比較不同花粉源面積和不同受體材料中的轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移頻率。

通過非線性回歸分析擬合指數(shù)衰減模型調(diào)查轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移與花粉源距離的關(guān)系:

y=a·exp-b·x。

(1)

式(1)中,y為轉(zhuǎn)基因漂移頻率,%;x為與花粉源的距離,m;a為截距;b為決定曲線斜率的曲線參數(shù),即衰減速率。通過指數(shù)衰減模型中估計的a和b值,根據(jù)式(2)～(3)估測轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移頻率下降50%(O50)和95%(O95)時的漂移距離:

O50=[ln (0.5·a)-lna]/-b,

(2)

O95=[ln (0.01·a)-lna]/-b。

(3)

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析,SigmaPlot軟件進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花粉源面積下轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移頻率

多因素方差分析結(jié)果顯示,花粉源面積和受體材料間的交互作用對轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移頻率有顯著影響(表1)。在揚麥158和矮敗小麥2種花粉受體中花粉源大小對小麥基因漂移距離的影響表現(xiàn)一致,400m2花粉源小麥轉(zhuǎn)基因在2種受體材料中漂移的最遠距離均為5m,100m2花粉源均為3m(表2)。但在花粉源相同距離處不同花粉源面積下,小麥基因漂移頻率在2種受體中的表現(xiàn)有明顯差異。t檢驗結(jié)果顯示,在揚麥158田塊中,400 m2花粉源小麥基因漂移頻率略高于100 m2,但兩者間無顯著差異(表2)。在矮敗小麥田塊中,100 m2花粉源0、1、2和3 m處小麥基因漂移頻率均略高于400 m2,但兩者間無顯著差異(表2)。

表1 花粉源面積、受體材料、與花粉源距離以及交互作用對轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移影響的多因素方差分析

Table 1 Multi-factor variance analysis of the effects of pollen source size, pollen receptor, distance from pollen source and their interactions on gene flow of transgenic wheat

影響因素dfFP花粉源面積11.2410.268花粉受體114.9120.000距離942.5530.000花粉源面積×花粉受體14.9630.028花粉源面積×距離90.7660.648花粉受體×距離93.2240.002花粉源面積×花粉受體×距離91.9150.056

df為自由度;F為F檢驗的統(tǒng)計量;P為顯著性檢驗的概率值;顯著性檢驗水平α=0.05。

表2 不同花粉源面積以及不同花粉受體中轉(zhuǎn)基因小麥的基因漂移頻率

Table 2 Gene flow frequency of transgenic wheat relative to pollen receptor and size of pollen source

距離/m揚麥158(YM)花粉源面積/m2矮敗小麥(DW)花粉源面積/m210040010040001.80±0.582.60±0.514.33±0.88*2.67±0.3311.00±0.451.40±0.402.33±0.331.67±0.3320.20±0.200.60±0.401.00±0.01*0.67±0.3330.20±0.200.20±0.201.00±0.580.33±0.33500.20±0.2000.33±0.33100000200000300000500000800000

數(shù)據(jù)為平均值±標準差。*表示0和2 m處小麥轉(zhuǎn)基因漂移頻率在100-YM與100-DW間差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同受體材料中轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移頻率

多因素方差分析結(jié)果顯示,受體材料與花粉源面積間有顯著的交互作用,且受體材料的主效應顯著(表1)。t檢驗結(jié)果顯示,就花粉源面積為100 m2處理而言,距花粉源0和2 m處轉(zhuǎn)基因小麥向矮敗小麥的基因漂移頻率顯著高于揚麥158(P<0.05),在其他距離處2種受體材料間無顯著差異,檢測到發(fā)生轉(zhuǎn)基因漂移的最遠距離均為3 m(表2)。就花粉源面積為400 m2的處理而言,距花粉源相同距離處2種受體的基因漂移頻率無顯著差異,發(fā)生基因漂移的最遠距離均為5 m(表2)。

2.3 不同距離處轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移頻率

距離對轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移頻率有顯著影響(表1)。在4個處理中,小麥轉(zhuǎn)基因漂移頻率均隨著距花粉源距離的增加迅速衰減,鄰近花粉源處的轉(zhuǎn)基因漂移頻率顯著偏高(P<0.05),5 m以后2種受體的基因漂移頻率均降為0。轉(zhuǎn)基因小麥的基因漂移頻率與距離呈指數(shù)衰減關(guān)系,回歸分析結(jié)果顯示R2的取值范圍為0.981～0.993,說明指數(shù)回歸模型的擬合度很好(表3,圖3)。同時根據(jù)4個處理擬合得到的指數(shù)衰減模型可以看出,不同處理條件下小麥轉(zhuǎn)基因漂移頻率隨距離增加的衰減速率有一定差異,在400 m2花粉源條件下矮敗小麥的衰減速率較慢(表3)。

表3 不同處理條件下轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移的指數(shù)衰減模型及判定系數(shù)

Table 3 Exponential decay model and determination coefficient (R2) of the gene flow of transgenic wheat relative to treatment

花粉受體花粉源面積/m2指數(shù)衰減模型1)R2P揚麥158100y=1.84e-0.78x0.9809<0.0001400y=2.63e-0.70x0.99380.0069矮敗小麥100y=4.32e-0.63x0.98890.0131400y=2.71e-0.60x0.98530.0026

1)x為距花粉源距離;y為小麥轉(zhuǎn)基因漂移頻率。

圖3 不同處理條件下轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移的回歸曲線 Fig.3 Regression curves of transgenic wheat gene flow relative to treatment

根據(jù)式(2)和(3)估測,當轉(zhuǎn)基因小麥在揚麥158中的基因漂移頻率下降50%時,在100和400 m2花粉源條件下的漂移距離分別為0.89和0.99 m;下降95%時的漂移距離分別為5.90和6.58 m;當矮敗小麥中的漂移頻率下降50%時,在100和400 m2花粉源條件下的漂移距離分別為1.10和1.16 m,下降95%時的漂移距離分別為7.31和7.68 m。

3 討論與結(jié)論

3.1 花粉源大小對轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移的影響

該研究中花粉源大小對小麥轉(zhuǎn)基因漂移頻率無顯著影響,這在以往的研究中也有類似結(jié)果。GUASTAFSON等[19]根據(jù)已有試驗數(shù)據(jù),通過回歸分析構(gòu)建小麥基因漂移的經(jīng)驗模型,預測小麥田間基因漂移頻率非常低,而且花粉源大小對基因漂移頻率無明顯影響。根據(jù)該經(jīng)驗模型,應用線性疊加的假設(shè)可以解釋筆者研究結(jié)果:面積400 m2花粉源的邊長比100 m2的增加1倍(圖1),增加的花粉源與非轉(zhuǎn)基因小麥受體田塊間隔10 m。由于小麥花粉基本上集中在花粉源周圍5 m以內(nèi),隨著距離增加供體的花粉密度迅速下降[9],花粉介導的轉(zhuǎn)基因漂移頻率在5 m以后就降為0,因此,盡管花粉源面積增加4倍,但非轉(zhuǎn)基因小麥接受到的花粉主要還是來自于緊鄰的(5 m內(nèi))轉(zhuǎn)基因小麥田塊,花粉源面積的增加不會必然導致轉(zhuǎn)基因漂移頻率的增加。此外,該研究中檢測到的最大轉(zhuǎn)基因漂移頻率發(fā)生在矮敗小麥中,為4.33%,這種較低的漂移頻率也有可能導致花粉源規(guī)模效應沒有明顯表現(xiàn)出來[20-21]。值得注意的是,400 m2花粉源處理下檢測到小麥轉(zhuǎn)基因漂移的最遠距離為5 m,而100 m2處理下為3 m,說明花粉源面積的增加可能會在一定程度上減緩小麥轉(zhuǎn)基因漂移的衰減速率,這跟筆者之前對于轉(zhuǎn)基因小麥花粉漂移的研究結(jié)果一致[9]。

3.2 花粉競爭對轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移的影響

該研究顯示花粉受體材料對小麥轉(zhuǎn)基因漂移頻率有顯著影響,在0和2 m處矮敗小麥的基因漂移頻率顯著高于揚麥158。已有研究表明,矮敗小麥異交率遠高于普通的栽培小麥[22]。這主要是因為矮敗小麥自交不結(jié)實,沒有自花授粉的競爭,只能接受外來花粉,而一般的小麥栽培品種都存在著強烈的自花授粉競爭,這也是造成小麥具有極低的異交率的主要原因之一[23-24],極低的異交結(jié)實率限制了基因的漂移頻率。值得關(guān)注的是,如果沒有非轉(zhuǎn)基因小麥的花粉競爭,矮敗小麥中基因漂移頻率應為100%[25],而該研究中矮敗小麥中的基因最大漂移頻率僅為4.33%。這可能是因為矮敗小麥群體中一半是矮桿敗育植株,一半是高桿可育植株,雖然在小麥開花前期人工去除了高桿植株,但仍有部分可能留存,其提供的花粉與來自于轉(zhuǎn)基因小麥的花粉形成了強烈競爭。而且這部分高桿可育植株混雜在矮敗小麥周圍,其花粉密度相對轉(zhuǎn)基因小麥的比例會隨著距花粉源距離的增加而增加,使得矮敗小麥更容易接受其周圍的非轉(zhuǎn)基因小麥花粉。WILLENBORG等[26]以抗除草劑(HR)轉(zhuǎn)基因春小麥為花粉供體,以4種不同基因型的非轉(zhuǎn)基因春小麥為花粉受體,調(diào)查了轉(zhuǎn)基因小麥向不同種群密度的栽培小麥田塊中的轉(zhuǎn)基因漂移頻率。結(jié)果顯示,當非轉(zhuǎn)基因小麥種群密度不超過300株·m-2時,隨著受體種群植株密度的增加,4種春小麥中轉(zhuǎn)基因漂移頻率均呈指數(shù)下降趨勢。這可能是受體植株密度增加導致其花粉密度的相對比例增加,相當于稀釋了來自于轉(zhuǎn)基因小麥的花粉,在花粉競爭情況下受體植株接受到了更高比例的非轉(zhuǎn)基因花粉。

3.3 轉(zhuǎn)基因小麥基因漂移與距花粉源距離的關(guān)系

在2種花粉受體中,小麥的基因漂移頻率均隨著距花粉源距離的增加而迅速降低。前期研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因小麥的花粉密度隨著距離的增加迅速衰減,小麥的基因漂移頻率與供體的花粉密度呈正相關(guān),且隨著花粉密度的下降而顯著降低。同時,基因漂移頻率的降低在一定程度上可能與供體花粉活力的下降有關(guān)系。LOUREIRO等[16]研究顯示在小麥盛花期,氣溫在20～25 ℃時,栽培小麥在散粉1 h后花粉活力就喪失了80%,花粉顆粒經(jīng)過長距離的傳播可能很難保持原有的活力,這也進一步說明距離隔離是降低小麥品種間花粉介導的基因漂移的有效措施。這一結(jié)果與之前對于小麥基因漂移的研究結(jié)果一致,小麥的基因漂移頻率或者異交率都有明顯的距離效應[27-28],距離隔離是控制自花授粉作物中花粉介導的基因漂移的最有效措施之一。

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