• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    五味子乙素對脂多糖誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞炎性損傷的影響及其作用機(jī)制研究

    2018-02-26 01:28:26王玲王鳳萍
    實用心腦肺血管病雜志 2018年12期
    關(guān)鍵詞:乙素五味子存活率

    王玲,王鳳萍

    五味子乙素(Schisandrin B)是從中草藥五味子中提取的脂素類物質(zhì),具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及參與免疫調(diào)節(jié)等作用[1]。研究表明,五味子乙素可通過增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)功能而減輕肝損傷[2-3],通過清除自由基而減輕心肌缺血/再灌注損傷及腦損傷等[4-5]。急性心肌梗死是臨床常見心血管疾病之一,可導(dǎo)致心肌缺血缺氧損傷及心肌重塑,引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡、炎癥、壞死[6],而心肌細(xì)胞凋亡、炎癥可造成急性心肌梗死進(jìn)一步加重并引發(fā)心肌功能障礙、心力衰竭等,導(dǎo)致患者死亡風(fēng)險升高[7]。胡開永等[8]研究表明,五味子乙素對阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性具有一定保護(hù)作用,但五味子乙素減輕心肌細(xì)胞炎性損傷的具體機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討五味子乙素對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞炎性損傷的影響及其作用機(jī)制,以期為五味子乙素的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料及試劑 心肌H9c2細(xì)胞(購自杭州赫貝科技有限公司),五味子乙素(北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:65205-64-2),胎牛血清(FBS)(Gibco公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:SR01C-657);DMEM完全培養(yǎng)基(Invitrogen 公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:20171009),八肽膽囊收縮素(CCK8)試劑盒(江蘇科晶生物科技有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:WST-8),磷脂酰絲氨酸蛋白抗體/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡試劑盒(江蘇凱基生物科技有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:KGA106);白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒均購自江蘇科晶生物科技有限公司,生產(chǎn)批號分別為MT1628、MT5416;RIPA裂解液(杭州碧云天公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:HBS0637),二辛酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(杭州碧云天公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:P1527),增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)(上海翊圣生物科技有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:P00018);β-actin(生產(chǎn)批號:abs103627)、PI3K(生產(chǎn)批號:abs256107)、Akt(生產(chǎn)批號:abs021054)、p-Akt(生產(chǎn)批號:abs120584)、FoxO1(生產(chǎn)批號:abs201352)、p-FoxO1(生產(chǎn)批號:abs003266)一抗均購自英國Abcam公司,二抗羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(美國LI-COR Biosciences公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:HS20171106)。

    1.2 儀器及設(shè)備 BBS-V800單人超凈臺(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)),HERAcell 2401細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司生產(chǎn)),HBS-1096A酶標(biāo)儀(上海京工實業(yè)有限公司生產(chǎn)),Attune NxT流式細(xì)胞儀(Thermo Fisher Scientific 公司生產(chǎn)),GenoSens 1850 凝膠成像儀(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))。

    1.3 心肌H9c2細(xì)胞培養(yǎng)方法 2017 年3月—2018年1月,采用包含10% FBS、1%雙抗溶液的DMEM完全培養(yǎng)基,將心肌H9c2細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃恒溫HERAcell 2401細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng),待心肌H9c2細(xì)胞生長至90%左右時培養(yǎng)瓶消毒后置于BBS-V800單人超凈臺,棄去舊培養(yǎng)基,加入無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍后加入胰酶消化,顯微鏡下觀察心肌H9c2細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化,離心后棄去舊培養(yǎng)基并加入新鮮培養(yǎng)基吹打心肌H9c2細(xì)胞,按1:3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

    1.4 分組方法 五味子乙素對心肌H9c2細(xì)胞的毒性試驗結(jié)果表明,150 mg/L五味子乙素對心肌H9c2細(xì)胞無明顯毒性,且采用10、50、150 mg/L濃度梯度的五味子乙素對H9c2細(xì)胞進(jìn)行試驗有望得到最佳結(jié)果,因此本實驗將傳代培養(yǎng)的心肌H9c2細(xì)胞接種于96孔板上并分為正常對照組(A組)、LPS誘導(dǎo)組(B組)、LPS+低劑量五味子乙素組(C組)、LPS+中劑量五味子乙素組(D組)、LPS+高劑量五味子乙素組(E組),細(xì)胞生長貼壁后A組心肌H9c2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),B組心肌H9c2細(xì)胞僅加入含1 mg/L的LPS,C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞在B組基礎(chǔ)上分別加入10、50、150 mg/L五味子乙素,后共同置于 5% CO2、37 ℃恒溫 HERAcell 2401細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

    1.5 觀察指標(biāo)

    1.5.1 細(xì)胞相對存活率 5組心肌H9c2細(xì)胞經(jīng)處理后棄去舊培養(yǎng)基,每孔加入10 μl CCK8試劑,置于HERAcell 2401細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h,采用HBS-1096A酶標(biāo)儀測定心肌H9c2細(xì)胞吸光度OD值并計算細(xì)胞相對存活率。

    1.5.2 細(xì)胞凋亡率 5組心肌H9c2細(xì)胞經(jīng)處理后加入1 μl Annexin-FITC 混勻,后加入 5 μl PI混勻,避光反應(yīng)5 min,采用Attune NxT流式細(xì)胞儀檢測心肌H9c2細(xì)胞凋亡率,第2、4象限心肌H9c2細(xì)胞百分比即為心肌H9c2細(xì)胞凋亡率。

    1.5.3 炎性因子含量 5組心肌H9c2細(xì)胞經(jīng)處理后收集上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-6、TNF-α含量,嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

    1.5.4 PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1 蛋 白 相 對表達(dá)量 5組心肌H9c2細(xì)胞處理后每孔加入200 μl RIPA裂解液并置于冰上充分裂解30 min,以β-actin為參照,采用BCA蛋白濃度測定試劑盒、免疫印跡法(Western Blot)法檢測并計算心肌H9c2細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量。每孔加入50 μg心肌H9c2細(xì)胞進(jìn)行凝膠電泳:275 mA恒流下轉(zhuǎn)膜90 min,5%脫脂牛奶封閉條帶1 h,一抗孵育:PI3K(稀釋濃度為1:1 000),Akt(稀釋濃度為1:1 000),p-Ak(t稀釋濃度為1:1 000),F(xiàn)oxO1(稀釋比濃度為1:1 000),p-FoxO1(稀釋濃度為1:1 000);4 ℃搖床上緩慢振搖過夜,Tris-HCl緩沖鹽溶液-吐溫20(TBST)洗膜3次,8 min/次,后將條帶置入二抗羊抗兔IgG溶液(稀釋濃度為1:3 000),常溫?fù)u床上緩慢振搖1 h,ECL顯色后采用GenoSens 1850凝膠成像儀顯影,采用Image J軟件進(jìn)行半定量分析,凝膠電泳結(jié)果見圖1。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料以(x± s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    圖1 心肌 H9c2細(xì)胞 PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1蛋白電泳圖Figure 1 Protein electrophoresis of PI3K,Akt,p-Akt,F(xiàn)oxO1 and p-FoxO1 in myocardial H9c2 cells

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)胞相對存活率 以A組為參照(100%),B、C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率分別為(49.3±5.8)%、(58.6±6.7)%、(67.4±5.9)%、(81.3±7.4)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.32,P<0.05);C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于B組,D、E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于C組,E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2 細(xì)胞凋亡率 A、B、C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋 亡 率 分 別 為(4.6±1.4)%、(46.5±7.6)%、(37.1±5.4)%、(28.4±4.8)%、(19.5±2.7)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.17,P<0.05);B、C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率高于A組,C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率低于B組,D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率低于C組,E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率低于D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.3 炎性因子含量 5組心肌H9c2細(xì)胞IL-6、TNF-α含量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);B、C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞IL-6、TNF-α含量高于A組,C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞IL-6、TNF-α含量低于B組,D、E組心肌H9c2細(xì)胞IL-6、TNF-α含量低于C組,E組心肌H9c2細(xì)胞IL-6、TNF-α含量低于D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

    2.4 PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1 蛋白相對表達(dá)量 5組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而5組心肌H9c2細(xì)胞Akt、FoxO1蛋白相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);B、C、D組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量低于A組,C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于B組,D、E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于C組,E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

    表1 5組心肌H9c2細(xì)胞炎性因子含量比較(,ng/L)Table 1 Comparison of inflammatory cytokines contents in myocardial H9c2 cells in the five groups

    表1 5組心肌H9c2細(xì)胞炎性因子含量比較(,ng/L)Table 1 Comparison of inflammatory cytokines contents in myocardial H9c2 cells in the five groups

    注:IL-6=白介素6,TNF-α=腫瘤壞死因子α;與A組比較,aP<0.05;與B組比較,bP<0.05;與C組比較,cP<0.05;與D組比較,dP<0.05

    組別 IL-6 TNF-α A 組 536.3±114.5 84.5±12.6 B 組 1 754.6±294.6a 195.6±26.8a C 組 1 453.5±238.5ab 152.3±23.7ab D 組 1 054.2±204.2abc 120.4±16.5abc E組 687.7±128.1abcd 90.2±14.6abcd F值 16.305 10.329 P值 <0.05 <0.05

    表2 5組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量比較(x± s)Table 2 Comparison of relative protein expression quantity of PI3K,Akt,p-Akt,F(xiàn)oxO1 and p-FoxO1 in myocardial H9c2 cells in the five groups

    3 討論

    大量臨床研究表明,急性心肌梗死患者體內(nèi)炎性因子表達(dá)水平尤其是梗死心肌IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯升高,而IL-6、TNF-α表達(dá)水平升高可進(jìn)一步導(dǎo)致心肌功能紊亂及心肌細(xì)胞凋亡、壞死[9]。炎性反應(yīng)是包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡、壞死的重要病理改變,降低細(xì)胞炎性因子含量有助于減輕細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示,C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于B組,D、E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于C組,E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于D組,表明五味子乙素可有效促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞增殖,且心肌H9c2細(xì)胞相對存活率隨著五味子乙素劑量增大而升高,表現(xiàn)出劑量依賴性;B 、C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量高于A組,C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量低于B組,D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量低于C組,E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量低于D組,表明五味子乙素可有效抑制LPS誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞凋亡并降低炎性因子含量,且心肌H9c2細(xì)胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量隨著五味子乙素劑量增大而降低,亦表現(xiàn)出劑量依賴性。

    PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路,Akt磷酸 化 為 p-Akt可 引 起 Caspase-3、Caspase-9、Bax的Ser184位點磷酸化而降低凋亡蛋白活性并上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡;此外,PI3K/Akt信號通路還可調(diào)控FoxO1磷酸化并導(dǎo)致其從胞核內(nèi)移出至胞質(zhì),繼而抑制轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合及細(xì)胞凋亡[10-11]。動物實驗結(jié)果表明,PI3K/Akt/FoxO1信號通路的激活有利于減輕心肌細(xì)胞損傷,而過氧化物酶增殖物激活受體α(PPAR-α)可通過激活PI3K/Akt/FoxO1信號通路負(fù)性調(diào)控心肌細(xì)胞肥大[12]。郭進(jìn)建等[13]研究發(fā)現(xiàn),康心飲可誘導(dǎo)缺血性心肌病大鼠心肌細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白表達(dá)量升高并激活PI3K/Akt/FoxO1信號通路,誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)下調(diào)及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào),從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,B、C、D組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量低于A組,C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于B組,D、E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于C組,E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于D組,表明五味子乙素可有效上調(diào)LPS誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白的表達(dá),激活PI3K/Akt/FoxO1信號通路,且PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白表達(dá)量隨著五味子乙素劑量增大而升高,表現(xiàn)出劑量依賴性,與上述研究結(jié)果一致。

    綜上所述,五味子乙素可有效促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞增殖、抑制心肌H9c2細(xì)胞凋亡、降低心肌H9c2細(xì)胞炎性因子含量,有利于減輕細(xì)胞炎性損傷,其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/FoxO1信號通路有關(guān);本實驗結(jié)果對臨床采用五味子乙素輔助治療心肌炎等心肌損傷性疾病具有一定參考價值,但本實驗僅為體外細(xì)胞學(xué)研究,尚缺乏動物學(xué)實驗結(jié)果支撐,結(jié)果結(jié)論仍需在今后的研究中進(jìn)一步證實。

    作者貢獻(xiàn):王玲進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計,研究的實施與可行性分析,對文章整體負(fù)責(zé),監(jiān)督管理;王鳳萍進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理及統(tǒng)計學(xué)處理,進(jìn)行論文的修訂,負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校;王玲、王鳳萍進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋,負(fù)責(zé)撰寫論文。

    本文無利益沖突。

    猜你喜歡
    乙素五味子存活率
    燈盞乙素在抑制冠脈搭橋術(shù)后靜脈橋再狹窄中的應(yīng)用
    燈盞乙素對OX-LDL損傷的RAW264.7細(xì)胞中PKC和TNF-α表達(dá)的影響
    園林綠化施工中如何提高植樹存活率
    損耗率高達(dá)30%,保命就是保收益!這條70萬噸的魚要如何破存活率困局?
    水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預(yù)計年產(chǎn)3.5萬斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
    HPLC-DAD法快速篩查五味子顆粒(糖漿)中南五味子代替五味子
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:26:02
    五味子醇甲提取純化方法的研究進(jìn)展
    中成藥(2017年3期)2017-05-17 06:09:06
    北五味子化學(xué)成分的研究
    中成藥(2017年3期)2017-05-17 06:09:01
    HPLC法同時測定五酯膠囊中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量
    五味子乙素對MDR1介導(dǎo)的人骨肉瘤細(xì)胞U-2OS/ADR所致多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)研究
    国产精品 国内视频| www日本在线高清视频| 国产成人欧美| 亚洲精品一二三| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 三级毛片av免费| 久久ye,这里只有精品| 曰老女人黄片| 黄色女人牲交| 午夜福利在线观看吧| 国产成人免费观看mmmm| 香蕉久久夜色| 男女午夜视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 最新美女视频免费是黄的| 国产乱人伦免费视频| 亚洲第一av免费看| 亚洲黑人精品在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 老司机在亚洲福利影院| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美在线一区亚洲| 夫妻午夜视频| 亚洲三区欧美一区| 男女床上黄色一级片免费看| 国产色视频综合| 国产片内射在线| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美在线黄色| 天天操日日干夜夜撸| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美不卡视频在线免费观看 | 欧美激情高清一区二区三区| 久久草成人影院| 一本综合久久免费| 亚洲国产看品久久| 中国美女看黄片| 夫妻午夜视频| 国产视频一区二区在线看| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美乱妇无乱码| 国产在线精品亚洲第一网站| 在线观看www视频免费| 人妻一区二区av| 久久性视频一级片| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 成人影院久久| 亚洲精品在线美女| 十八禁网站免费在线| 成人手机av| 两个人看的免费小视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 成年人免费黄色播放视频| 一区在线观看完整版| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 韩国精品一区二区三区| 极品教师在线免费播放| 中出人妻视频一区二区| 精品福利观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美精品av麻豆av| 一级毛片女人18水好多| 中文字幕人妻熟女乱码| 免费av中文字幕在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 大片电影免费在线观看免费| 99久久精品国产亚洲精品| 多毛熟女@视频| 国产免费男女视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲 国产 在线| 欧美在线黄色| 99re在线观看精品视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲av电影在线进入| 一区在线观看完整版| 精品欧美一区二区三区在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久精品国产综合久久久| 亚洲精品国产区一区二| 丁香欧美五月| 成人免费观看视频高清| 18在线观看网站| 欧美久久黑人一区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 女性生殖器流出的白浆| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美精品亚洲一区二区| 99热只有精品国产| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 日本wwww免费看| 黑人操中国人逼视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 在线看a的网站| √禁漫天堂资源中文www| 国产视频一区二区在线看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品国产一区二区久久| 激情在线观看视频在线高清 | 男男h啪啪无遮挡| 十八禁高潮呻吟视频| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲avbb在线观看| 悠悠久久av| 91成年电影在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 99热只有精品国产| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲一区中文字幕在线| 99热只有精品国产| 亚洲精品乱久久久久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 两个人免费观看高清视频| 久久久久国内视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲黑人精品在线| 一级毛片高清免费大全| 在线观看一区二区三区激情| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 日韩欧美三级三区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区精品| 色老头精品视频在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产av又大| 丝袜美足系列| 一进一出好大好爽视频| 视频区图区小说| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 黄色视频不卡| av网站在线播放免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美日韩乱码在线| 久久热在线av| 国产精品久久久久久精品古装| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲国产欧美一区二区综合| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| svipshipincom国产片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 999久久久国产精品视频| 日韩欧美三级三区| 黄频高清免费视频| 麻豆国产av国片精品| 成人18禁在线播放| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产不卡av网站在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 国产国语露脸激情在线看| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品一区二区精品视频观看| 丁香欧美五月| 99国产综合亚洲精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国精品久久久久久国模美| 国产99白浆流出| 成人免费观看视频高清| 成人18禁在线播放| 十八禁高潮呻吟视频| 最近最新免费中文字幕在线| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 两个人免费观看高清视频| 99香蕉大伊视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美日韩福利视频一区二区| 女同久久另类99精品国产91| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 看片在线看免费视频| 亚洲第一av免费看| 精品国产一区二区久久| 久热爱精品视频在线9| 啦啦啦 在线观看视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲精华国产精华精| 国精品久久久久久国模美| 国产成人欧美| 日本a在线网址| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 悠悠久久av| 亚洲七黄色美女视频| 人人澡人人妻人| videos熟女内射| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 免费在线观看完整版高清| 99热网站在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲av日韩在线播放| 高潮久久久久久久久久久不卡| 免费黄频网站在线观看国产| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品国产高清国产av | 中文字幕精品免费在线观看视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产一区二区激情短视频| av网站在线播放免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 夜夜爽天天搞| 国产免费男女视频| 91成年电影在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久精品国产a三级三级三级| 中国美女看黄片| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲精品在线美女| 午夜福利在线观看吧| 咕卡用的链子| 女人久久www免费人成看片| 免费av中文字幕在线| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 日本五十路高清| 丝袜人妻中文字幕| 国产精品国产高清国产av | 欧美日韩精品网址| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 成年人午夜在线观看视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 一级片'在线观看视频| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 精品国内亚洲2022精品成人 | 久久久国产成人精品二区 | 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 最新在线观看一区二区三区| 成人国产一区最新在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲专区国产一区二区| 精品国产乱码久久久久久男人| 怎么达到女性高潮| 欧美午夜高清在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 好男人电影高清在线观看| 99riav亚洲国产免费| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 在线天堂中文资源库| √禁漫天堂资源中文www| 免费看a级黄色片| 香蕉国产在线看| 欧美日韩av久久| 国产av精品麻豆| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲片人在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品在线观看二区| 99久久国产精品久久久| 妹子高潮喷水视频| 久久久久国内视频| 久热爱精品视频在线9| 香蕉丝袜av| 国产精品电影一区二区三区 | 99国产精品99久久久久| 天堂动漫精品| 精品第一国产精品| 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲成人免费av在线播放| 国产av又大| 久热爱精品视频在线9| 性色av乱码一区二区三区2| 久久国产亚洲av麻豆专区| 99热只有精品国产| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲美女黄片视频| 美女 人体艺术 gogo| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 丝袜美足系列| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 人妻久久中文字幕网| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲av美国av| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产在视频线精品| 国产精品九九99| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲国产看品久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 丁香欧美五月| 中出人妻视频一区二区| 一级a爱片免费观看的视频| 午夜老司机福利片| 欧美 日韩 精品 国产| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 欧美色视频一区免费| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲午夜理论影院| 露出奶头的视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产91精品成人一区二区三区| 午夜久久久在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久99久视频精品免费| 国产一区二区三区视频了| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲三区欧美一区| 成人手机av| 一边摸一边做爽爽视频免费| 高清毛片免费观看视频网站 | 好男人电影高清在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美亚洲日本最大视频资源| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲三区欧美一区| 久久九九热精品免费| 欧美成人午夜精品| 亚洲一区二区三区欧美精品| 麻豆乱淫一区二区| 十八禁人妻一区二区| 一级黄色大片毛片| 超色免费av| 在线观看免费视频日本深夜| 国产成人影院久久av| 久热爱精品视频在线9| av网站免费在线观看视频| www日本在线高清视频| 91av网站免费观看| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 看黄色毛片网站| 久久香蕉国产精品| 亚洲av片天天在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 老司机深夜福利视频在线观看| 日韩欧美免费精品| av超薄肉色丝袜交足视频| 色老头精品视频在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 午夜福利影视在线免费观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 正在播放国产对白刺激| 亚洲片人在线观看| 成人影院久久| 99re在线观看精品视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 一级毛片高清免费大全| 成在线人永久免费视频| 美国免费a级毛片| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美性长视频在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品国产高清国产av | 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 黄色片一级片一级黄色片| 999久久久国产精品视频| 免费在线观看黄色视频的| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 极品人妻少妇av视频| 日本五十路高清| 两人在一起打扑克的视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品午夜福利视频在线观看一区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 在线播放国产精品三级| 国产精品免费一区二区三区在线 | 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美大码av| 欧美激情 高清一区二区三区| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 啦啦啦在线免费观看视频4| 大香蕉久久网| 亚洲av成人一区二区三| 免费观看人在逋| 亚洲专区字幕在线| 交换朋友夫妻互换小说| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 大型av网站在线播放| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 欧美在线一区亚洲| 亚洲三区欧美一区| 日韩有码中文字幕| 丝瓜视频免费看黄片| 免费不卡黄色视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产高清国产精品国产三级| 午夜福利,免费看| 免费观看精品视频网站| 免费高清在线观看日韩| 亚洲国产精品合色在线| 日韩大码丰满熟妇| 欧美 日韩 精品 国产| 一进一出抽搐动态| 色在线成人网| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品二区激情视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 91av网站免费观看| 国产精品1区2区在线观看. | 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久九九热精品免费| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲欧美激情综合另类| av在线播放免费不卡| √禁漫天堂资源中文www| 宅男免费午夜| 黄色毛片三级朝国网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 大型黄色视频在线免费观看| 久久久国产成人精品二区 | 久久精品成人免费网站| 老汉色∧v一级毛片| 免费观看a级毛片全部| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久国产成人精品二区 | 免费看十八禁软件| 悠悠久久av| 免费在线观看亚洲国产| av在线播放免费不卡| av天堂久久9| 日韩三级视频一区二区三区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 免费观看a级毛片全部| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 国产不卡av网站在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 一级毛片精品| 日韩欧美免费精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产一区二区三区视频了| 男人操女人黄网站| 亚洲伊人色综图| 亚洲综合色网址| 黄色女人牲交| 中文字幕av电影在线播放| 大陆偷拍与自拍| 757午夜福利合集在线观看| 国产成人影院久久av| 午夜视频精品福利| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品国产av在线观看| 免费在线观看日本一区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 老熟女久久久| 国产精品久久电影中文字幕 | www.熟女人妻精品国产| 亚洲精品美女久久av网站| 黄色毛片三级朝国网站| 捣出白浆h1v1| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日韩精品免费视频一区二区三区| 女人精品久久久久毛片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 69精品国产乱码久久久| 嫩草影视91久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲情色 制服丝袜| 日本黄色日本黄色录像| 无限看片的www在线观看| 亚洲精品自拍成人| 日韩免费av在线播放| 在线av久久热| 久久精品国产清高在天天线| 在线国产一区二区在线| 日韩人妻精品一区2区三区| 黄色 视频免费看| 首页视频小说图片口味搜索| a级片在线免费高清观看视频| 在线观看免费高清a一片| 久久99一区二区三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 一级毛片女人18水好多| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲熟女毛片儿| 精品国产一区二区久久| 黄色女人牲交| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲精品自拍成人| 乱人伦中国视频| 国产精品免费大片| 美女高潮到喷水免费观看| www日本在线高清视频| 香蕉国产在线看| 色在线成人网| 人人澡人人妻人| 91av网站免费观看| 热re99久久精品国产66热6| 精品久久久久久电影网| 国产精品久久久人人做人人爽| 看片在线看免费视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品电影一区二区在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 大香蕉久久网| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产成人av教育| 两个人免费观看高清视频| 91精品国产国语对白视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久久久久久国产电影| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲中文av在线| 老司机在亚洲福利影院| 热99re8久久精品国产| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 久久久久久久精品吃奶| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美色视频一区免费| 搡老岳熟女国产| 免费观看精品视频网站| 男女下面插进去视频免费观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品.久久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产麻豆69| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 麻豆av在线久日| 久久精品国产a三级三级三级| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲性夜色夜夜综合| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 在线av久久热| 捣出白浆h1v1| 国产乱人伦免费视频| 美女 人体艺术 gogo| 热99久久久久精品小说推荐| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久性视频一级片| 啦啦啦免费观看视频1| 一级毛片精品| 亚洲精品自拍成人| 精品亚洲成国产av| 精品国产乱子伦一区二区三区| 大型av网站在线播放| 好男人电影高清在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 丝袜美腿诱惑在线| 国产99白浆流出| 欧美另类亚洲清纯唯美| 91成年电影在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 久久草成人影院| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产精品99久久99久久久不卡| 极品人妻少妇av视频| 亚洲av美国av| 亚洲一区中文字幕在线| 精品无人区乱码1区二区| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美性长视频在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 国产不卡av网站在线观看| 一本大道久久a久久精品| 午夜精品久久久久久毛片777| 久热这里只有精品99| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美日韩视频精品一区| 久久狼人影院| 在线国产一区二区在线| 两性夫妻黄色片| 国产一区在线观看成人免费| 国精品久久久久久国模美| 视频在线观看一区二区三区| 在线视频色国产色| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久精品91无色码中文字幕| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 最近最新中文字幕大全免费视频| 韩国精品一区二区三区| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美在线一区亚洲| 新久久久久国产一级毛片| 午夜免费鲁丝| 国产精品久久视频播放| 国产精品久久久av美女十八| 91精品国产国语对白视频| 大香蕉久久成人网| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产又爽黄色视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品久久久人人做人人爽| 超碰成人久久| 操出白浆在线播放|