DDR相關(guān)蛋白缺陷引起的原發(fā)性免疫缺陷表型研究進(jìn)展

曾憲思，賈金婧，陳 磊，余亞軍，宋新強(qiáng)

(1.信陽(yáng)師范學(xué)院a.生命科學(xué)學(xué)院; b.大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院, 河南 信陽(yáng) 464000；2.信陽(yáng)市林業(yè)工作站，河南 信陽(yáng) 464000)

0 引言

外源性刺激或內(nèi)源性壓力可以導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB).在細(xì)胞自身調(diào)控過(guò)程中還存在程序性DSB，如可變區(qū)基因(多樣化基因)連接區(qū)基因片段重組(variable(diversity)joining recombination，V(D)J)和類別轉(zhuǎn)換重組(class switch recombination，CSR)均可產(chǎn)生程序性DSB.DSB是最嚴(yán)重的DNA損傷類型.細(xì)胞在應(yīng)對(duì)DNA損傷時(shí)會(huì)啟動(dòng)DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)，包括DNA損傷部位的檢測(cè)、DNA損傷信號(hào)的傳遞與DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)的啟動(dòng)即啟動(dòng)非同源末端連接途徑(non-homologous end joining，NHEJ)修復(fù)DNA損傷.

DDR對(duì)維持正常的細(xì)胞功能至關(guān)重要，DNA雙鏈斷裂被正確修復(fù)后細(xì)胞可以存活，被錯(cuò)誤修復(fù)將導(dǎo)致染色體畸變或易位，這種含有DNA損傷的病變細(xì)胞可發(fā)展為惡性腫瘤.程序性DDR障礙將導(dǎo)致原發(fā)性免疫缺陷(primary immunodeficiency，ID)[1].DNA損傷信號(hào)或NHEJ缺陷的病人具有PID表型，包括放射敏感性、惡性腫瘤易感性、發(fā)育遲緩與神經(jīng)功能缺損[2].這些疾病使我們認(rèn)識(shí)了每一DDR相關(guān)蛋白的生理意義和功能.本文將介紹V(D)J重組與CSR產(chǎn)生程序性DDR的分子機(jī)制，以及DDR相關(guān)蛋白缺陷導(dǎo)致的PID表型.

1 V(D)J重組與CSR重組產(chǎn)生DDR的分子機(jī)制

1.1 V(D)J重組

V(D)J重組是發(fā)生在免疫球蛋白與T細(xì)胞受體的DNA重排過(guò)程，對(duì)B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要.為了應(yīng)對(duì)外來(lái)抗原，淋巴細(xì)胞將產(chǎn)生大量的抗原受體，包括B細(xì)胞受體和T細(xì)胞受體.這些受體可變域即抗原結(jié)合域的編碼基因是由彼此分離的2或3個(gè)基因片段(VJ或VDJ)通過(guò)V(D)J重組組裝而成，而V、D和J片段本身具有不同的拷貝，因此通過(guò)V、D、J基因片段的重組或V、J基因片段的重組可使抗原受體呈現(xiàn)多樣性.淋巴細(xì)胞特有的重組酶RAG1/2與每一個(gè)即將發(fā)生重排V、D、J片段兩端的重組信號(hào)序列(recombination signal sequences，RSS)結(jié)合，催化基因片段本身和RSS之間的雙鏈DNA斷裂，最后通過(guò)NHEJ將斷裂的DNA末端連接起來(lái)[3].當(dāng)發(fā)生DSB時(shí)，B細(xì)胞受體或T細(xì)胞受體基因編碼區(qū)末端形成共價(jià)封閉的DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)，DNA依賴的蛋白激酶(DNA dependent protein kinase，DNA-PK)的調(diào)節(jié)亞基Ku70/80與DNA-PK催化亞基(DNA-PK catalytic subunit，DNA-PKcs)結(jié)合在發(fā)卡結(jié)構(gòu)上，形成具有全酶活性的DNA-PK；然后，募集Artemis與DNA-PKcs形成復(fù)合體.DNA-PK磷酸化Artemis，活化的Artemis具有核酸內(nèi)切/外切酶活性可打開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu).DNA損傷信號(hào)分子在這種程序性DDR中也具有重要作用.ATM與MRE11-RAD50-NBS1復(fù)合物(MRN)募集在DNA斷裂位點(diǎn)并啟動(dòng)DDR信號(hào)[4,5].環(huán)指蛋白168(ring finger protein168，RNF168)與p53結(jié)合蛋白1(p53-binding protein 1，53BP1)也可以促進(jìn)DDR，RNF168可以對(duì)53BP1進(jìn)行泛素化修飾[6].最后，DNA連接酶IV/XRCC4-XLF復(fù)合物通過(guò)NHEJ修復(fù)DSB[7].

1.2 CSR重組

免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換重組(class switch recombination，CSR)發(fā)生在其重鏈的恒定區(qū)，Cμ被 Cγ、Cα或 Cε取代后形成IgG、IgA與IgE.B細(xì)胞可以進(jìn)行CSR即Ig重鏈區(qū)被另一個(gè)Ig區(qū)所取代，使B細(xì)胞產(chǎn)生不同的Ig亞型.活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(activation-induced cytidine deaminase，AID) 可以將轉(zhuǎn)錄活化的S區(qū)的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶并啟動(dòng)CSR.引入的尿嘧啶被尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase，UNG)修飾并通過(guò)堿基切除修復(fù)途徑切除，脫堿基位點(diǎn)被脫嘌呤/脫嘧啶核苷酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)生DNA單鏈斷裂(single strand break，SSB)，SSB隨后轉(zhuǎn)變?yōu)镈SB.錯(cuò)配修復(fù)也可以通過(guò)MMR復(fù)合物(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2與 EXO1)產(chǎn)生DSB.Sμ/Sx突觸由ATM/MRN/53BP1/RNF168/γ-H2AX修復(fù)后，隨后通過(guò)與V(D)J重組最后過(guò)程相同的機(jī)理進(jìn)行修復(fù)[8].CSR過(guò)程盡管不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，但也需Artemis參與[9].

2 V(D)J重組中DDR相關(guān)蛋白缺陷及其引起的表型

2.1 ATM缺陷

ATM激酶通過(guò)磷酸化多種DDR分子在DDR中發(fā)揮核心作用.ATM激酶不僅可以修復(fù)DSB、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、決定細(xì)胞命運(yùn)，還參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、端粒與線粒體維持、無(wú)義介導(dǎo)的衰變與自噬.ATM缺失會(huì)導(dǎo)致體細(xì)胞同源修復(fù)缺陷，抑制ATM活性則顯著降低同源修復(fù)[10].ATM激酶缺陷與染色體破碎增加密切相關(guān)，導(dǎo)致易患白血病等惡性腫瘤[11].ATM突變可引起共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxia telangiectasia，A-T).A-T是一種常染色體隱性遺傳并涉及多系統(tǒng)病變的神經(jīng)退行性疾病，其主要特征為早發(fā)性共濟(jì)失調(diào)、毛細(xì)血管擴(kuò)張以及惡性腫瘤發(fā)病率增加[12].A-T最顯著的臨床表現(xiàn)是放射敏感性.大約30%的A-T患者表現(xiàn)出免疫缺陷，如由V(D)J重排效率降低與新生T細(xì)胞減少引起的T細(xì)胞數(shù)目減少.A-T患者中通常發(fā)生血清α-胎蛋白減少、7號(hào)染色體與14號(hào)染色體的易位等變化.

2.2 MRN復(fù)合物缺陷

在DDR信號(hào)中，MRE11、RAD50和NBN(NBS1)形成復(fù)合物結(jié)合DSB通過(guò)激活A(yù)TM激酶引發(fā)細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn),從而在DNA修復(fù)中發(fā)揮功能，每一組分對(duì)穩(wěn)定復(fù)合物的形成至關(guān)重要，但在免疫反應(yīng)尤其是V(D)J重組與CSR中的功能卻各不相同.MRE11缺陷患者表現(xiàn)出共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥樣障礙，如共濟(jì)失調(diào)、小腦萎縮和眼睛不適，但不發(fā)生毛細(xì)血管擴(kuò)張.MRE11缺陷患者并未出現(xiàn)免疫學(xué)異常，但易患惡性腫瘤[13].NBS1的磷酸化狀態(tài)決定端粒DNA的修復(fù)選擇[14]，NBN缺陷可以導(dǎo)致奈梅亨斷裂綜合征(Nijmegen Breakage syndrome，NBS)，即染色體不穩(wěn)定綜合征，特征為小頭癥、鳥(niǎo)樣臉、生長(zhǎng)遲緩、輕度智力低下、免疫缺陷和癌癥高發(fā).免疫學(xué)研究表明幾乎一半的淋巴細(xì)胞明顯減少的患者伴有輕度或重度的白細(xì)胞減少.T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量降低的大部分患者伴有CD4+T細(xì)胞的減少，且四分之三的NBS患者出現(xiàn)了B細(xì)胞減少.RAD50的ATPase活性是MRN復(fù)合物的催化核心之一，受DNA末端調(diào)控[15]，其缺陷可以導(dǎo)致與NBS相似的表型，如小頭癥、智力遲鈍、鳥(niǎo)樣臉與身材矮小，但淋巴細(xì)胞數(shù)量和免疫球蛋白表達(dá)水平均正常[16].

2.3 RAG1/2缺陷

RAG1/2在V(D)J重組中具有重要作用，其突變將導(dǎo)致B細(xì)胞與T細(xì)胞缺陷,并表現(xiàn)出B-T-NK+重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)表型.用RAG1免疫缺陷患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞模擬PID可改變T細(xì)胞的發(fā)育[17].重組活性部分喪失的患者表現(xiàn)出多種表型，如Omenn綜合征(Omenn syndrome，OS)，該病的早期臨床表現(xiàn)為紅皮病、肝脾腫大、淋巴結(jié)腫大、脫發(fā)、常伴嗜酸性粒細(xì)胞與血清IgE升高.據(jù)報(bào)道，在常見(jiàn)變異型免疫缺陷病與IgA缺乏癥的病人中存在RAG1的次形態(tài)突變[18].盡管RAG1/2缺陷的SCID患者對(duì)放射不敏感，也沒(méi)有表現(xiàn)出發(fā)育延遲，但確診后就需要盡快進(jìn)行造血細(xì)胞移植.

2.4 Artemis缺陷

核酸酶Artemis對(duì)B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要，其C-端和催化結(jié)構(gòu)域的生理相互作用可介導(dǎo)自身活性抑制[19].DNA-PKcs 與ATM可以磷酸化Artemis，但其活化主要由DNA-PKcs所催化.Artemis編碼基因DCLRE1C缺陷表現(xiàn)出B-T-NK+放射敏感型SCID[20].DCLRE1C突變通常發(fā)生在N-末端區(qū)域?qū)е缕浜怂崦富钚詥适?DCLRE1C啟動(dòng)子前存在假DCLRE1C基因，由野生型DCLRE1C與假DCLRE1C基因之間的同源重組引起外顯子1-3或1-4的缺失是最常見(jiàn)的突變.DCLRE1C的次形態(tài)突變可引起非典型SCID、OS、高IgM綜合征等表型，然而Volk等研究證明Artemis突變僅導(dǎo)致抗體缺陷[21].Artemis缺陷的病人易患淋巴瘤.與LIG IV缺陷或XLF缺陷相比，Artemis缺陷的放射敏感性并不顯著，且患者沒(méi)有出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩或神經(jīng)功能缺損等癥狀.

2.5 DNA連接酶IV (LIG IV) 缺陷

DNA連接酶IVA(DNA ligase IV，LIG IV)是DNA連接酶家族成員之一，參與V(D)J重組過(guò)程中DSB的修復(fù)，可激活A(yù)rtemis 的核酸酶活性[22].LIG IV缺陷最初在白血病患者中發(fā)現(xiàn)，且化療對(duì)該患者具有嚴(yán)重副作用.隨后，在小頭畸形、生長(zhǎng)遲緩、全血細(xì)胞減少和不同程度免疫功能障礙的患者中也發(fā)現(xiàn)了LIG IV缺陷.這些病人的表型介于正常人與B-T-NK+放射敏感的SCID之間.LIG IV缺陷后引起的常見(jiàn)癥狀包括生長(zhǎng)不足、嚴(yán)重的小頭畸形、全血細(xì)胞減少且易患淋巴惡性腫瘤[23].LIG IV的錯(cuò)義突變使其活性降低并表現(xiàn)出聯(lián)合免疫缺陷.患者隨著B(niǎo)、T和NK細(xì)胞的減少而呈現(xiàn)出廣泛的免疫學(xué)異常.

2.6 XLF(NHEJ1)缺陷

在NHEJ中，XLF與XRCC4-LIG IV相互作用激活其連接酶活性進(jìn)行損傷修復(fù)，由于XLF是LIG IV復(fù)合物的一個(gè)組成部分，因此推測(cè)XLF在V(D)J重組中具有重要作用.XLF基因突變可導(dǎo)致端粒酶基因表達(dá)降低和端粒變短[24].XLF可以引起N-核苷酸的插入從而產(chǎn)生受體多樣性[25].在放射敏感性SCID與血細(xì)胞減少的患者中發(fā)現(xiàn)了XLF缺陷，導(dǎo)致造血干細(xì)胞損傷與早衰并引起血細(xì)胞減少[26].XLF突變病人小頭畸形、淋巴球減少、生長(zhǎng)阻滯，并表現(xiàn)出免疫缺陷和放射敏感性[27].然而，與其他SCID相比，XLF對(duì)免疫系統(tǒng)的影響相對(duì)較小.最近研究表明XLF不是V(D)J重組必需的.XLF缺陷小鼠一種新的NHEJ因子PAXX可促進(jìn)Ku在DSB處募集修復(fù)損傷[28].RAG蛋白除了識(shí)別并結(jié)合RSS以外，在斷裂末端的解離與重接中也具有重要作用.XLF缺失時(shí)，RAG復(fù)合物在DSB修復(fù)中起輔助作用[29].

2.7 PRKDC(DNA-PKcs)缺陷

DNA-PK由DNA-PKcs和Ku70/80組成，在NHEJ DNA修復(fù)途徑中發(fā)揮重要作用[30].DNA-PKcs與Ku70/80在人體內(nèi)含量豐富，它們?cè)诨蚪M穩(wěn)定性的維持中可能起到一定作用.突變的DNA-PKcs具有正常的激酶活性，但不能活化Artemis.van Der Burg對(duì)沒(méi)有出現(xiàn)發(fā)育遲緩或RAG1/2突變的B-T-NK+重癥聯(lián)合免疫缺陷患者進(jìn)行基因分析發(fā)現(xiàn)了PRKDC的純合突變[31].Mathieu等研究發(fā)現(xiàn)PRKDC缺陷患者的DNA-PKcs蛋白水平減少、激酶活性檢測(cè)不到且DSB修復(fù)受損，該患者具有小頭畸形、發(fā)育遲緩與嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺陷，表明DNA-PKcs在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中具有重要作用，同時(shí)DNA-PKcs突變不能誘導(dǎo)自身免疫調(diào)節(jié)因子依賴的基因表達(dá)，會(huì)出現(xiàn)器官特異性的自免疫炎癥疾病[32].

3 CSR重組中DDR相關(guān)蛋白缺陷及其引起的表型

3.1 AID缺陷與UNG缺陷

B細(xì)胞中AID對(duì)抗體多樣性非常關(guān)鍵，它通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA斷裂來(lái)進(jìn)行CSR、基因轉(zhuǎn)換與體細(xì)胞超突變(somatic hypermutation，SHM)[33].編碼AID的AICDA基因缺陷是引起常染色體隱性遺傳高IgM綜合征最常見(jiàn)的原因[34]，UNG缺陷也可以導(dǎo)致高IgM綜合征.發(fā)生應(yīng)激時(shí)AID的表達(dá)上調(diào)，并將兩條DNA鏈上IgH基因轉(zhuǎn)換區(qū)的脫氧胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)化為脫氧尿嘧啶而啟動(dòng)CSR，隨后UNG將DNA上的脫氧尿嘧啶移除并啟動(dòng)DNA修復(fù)途徑[35].AID缺陷與UNG缺陷表現(xiàn)出淋巴結(jié)增生.對(duì)22個(gè)AID缺陷的患者進(jìn)行分析，其中6個(gè)患者有自身免疫病或炎癥，包括糖尿病、關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎、溶血性貧血、免疫性血小板減少癥、克羅恩病和慢性葡萄膜炎.

3.2 INO80缺陷

INO80是染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物的組成成分，哺乳動(dòng)物INO80是端粒復(fù)制必需的，能維持基因組的穩(wěn)定性[36].INO80通過(guò)移除DNA損傷部位的H2A.Z促進(jìn)突觸前纖維形成，進(jìn)而促進(jìn)了同源重組修復(fù)[37].在B細(xì)胞中的Sα和Eμ區(qū)域可以檢測(cè)到INO80與黏附亞單位SMC，表明INO80在CSR中具有一定作用.Kracker等在兩名IgM水平正常、IgG和IgA水平降低的患者中發(fā)現(xiàn)了INO80的缺陷[8].有研究表明，INO80可促進(jìn)子宮肌瘤和非小細(xì)胞性肺癌等腫瘤的發(fā)生，提示我們靶向INO80染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物可能是潛在的腫瘤治療策略[38].

3.3 錯(cuò)配修復(fù)缺陷

在遺傳性非息肉病性結(jié)腸直腸癌與林奇綜合征患者中發(fā)現(xiàn)了錯(cuò)配修復(fù)基因的突變.結(jié)構(gòu)性錯(cuò)配修復(fù)缺陷(constitutional mismatch repair deficiency，CMMRD)綜合征是一種惡性腫瘤易感疾病，該病源于四個(gè)錯(cuò)配修復(fù)基因PMS2、MSH6、MSH2或 MLH1的雙等位基因突變[39].該病瘤譜很廣，主要包括血液、大腦和腸道腫瘤.PMS2缺陷會(huì)導(dǎo)致DNA先導(dǎo)鏈的高突變性，進(jìn)而導(dǎo)致早期腦腫瘤發(fā)作[40].MSH6缺陷可以適度減少IgG尤其是IgG2亞型的水平，但不能減少IgA的水平，這種缺陷導(dǎo)致了Ig-CSR部分缺陷與SHM異常.體細(xì)胞MSH2和MLH1突變引起的錯(cuò)配修復(fù)缺陷會(huì)導(dǎo)致林奇綜合征樣腫瘤[41].

3.4 RNF168缺陷

發(fā)生DSB時(shí)，E3連接酶RNF168通過(guò)使H2A泛素化調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)[42].同時(shí)RNF168還介導(dǎo)53BP1的泛素化，這一修飾對(duì)53BP1在DSBs位點(diǎn)的募集和發(fā)揮其DNA損傷修復(fù)、檢驗(yàn)點(diǎn)調(diào)節(jié)與基因組完整性的維持等功能至關(guān)重要[6].RNF168缺陷會(huì)導(dǎo)致放射敏感性、免疫缺陷、體態(tài)異常和學(xué)習(xí)困難(RIDDLE)綜合征，它是一種與DSB修復(fù)缺陷有關(guān)的免疫缺陷病[43].RIDDLE患者體內(nèi)IgG 與IgA水平減少，且其臨床特點(diǎn)與A-T相同.RIDDLE患者細(xì)胞內(nèi)53BP1與 BRCA1在DSBs上的重新定位受損，但MDCI與NBS1在DSBs上的重新定位并未受到影響.

4 DDR缺陷導(dǎo)致免疫缺陷的治療措施

無(wú)論NK細(xì)胞是否存在，B-T-放射敏感性SCID表型的患者都會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或嚴(yán)重感染，因此治療時(shí)需要重建免疫系統(tǒng).B-T-放射敏感性SCID包括DCLRE1C (Artemis)、LIG IV與XLF的缺陷.對(duì)放射敏感性SCID進(jìn)行造血細(xì)胞移植的結(jié)果表明，最小劑量的烷化劑和電離輻射對(duì)于提高存活率和降低遠(yuǎn)期影響至關(guān)重要[44].清髓性預(yù)處理方案很容易導(dǎo)致LIG IV與XLF的缺陷患者死亡，需要采用降低強(qiáng)度預(yù)處理方案.另一方面，患者殘余的NK活性會(huì)排斥供體造血細(xì)胞.Artemis缺陷不會(huì)導(dǎo)致造血干細(xì)胞缺陷，在移植前需要用藥物來(lái)清除宿主造血細(xì)胞和打開(kāi)骨髓龕.目前常用的一個(gè)預(yù)處理方案是氟達(dá)拉濱、低劑量環(huán)磷酰胺和血清療法聯(lián)合治療以清除T細(xì)胞.我們期待能研發(fā)出一種可抑制殘余NK細(xì)胞活性和產(chǎn)生骨髓龕的非基因毒性預(yù)處理方案.

5 展望

近年來(lái)對(duì)DDR相關(guān)蛋白缺陷引起的原發(fā)性免疫缺陷表型進(jìn)行了比較廣泛的研究，這可為相關(guān)疾病的臨床診斷提供依據(jù)，為其臨床治療提供很好的思路.盡管如此，DDR相關(guān)蛋白缺陷所致原發(fā)性免疫缺陷疾病的確切致病機(jī)制仍不完全清楚.因此構(gòu)建新的DDR缺陷相關(guān)原發(fā)性免疫缺陷疾病動(dòng)物模型，尤其是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，這將有利于更好地研究并闡明其發(fā)病機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展更具針對(duì)性的治療.