柑橘素預(yù)處理對大鼠缺血/再灌注心臟損傷后能量代謝的影響

[摘要] 目的 探討柑橘素預(yù)處理對大鼠缺血/再灌注心臟損傷后能量代謝的影響。 方法 將50只雄性成年Sprague-Dawlay大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為五組（n = 10）：空白對照組、模型組和柑橘素低、中、高劑量組（5、10、20 μmol/L）。各組大鼠心臟分別給予30 min全心缺血，然后給予120 min再灌注;柑橘素低、中、高劑量組大鼠分別在缺血前給予5、10、20 μmol/L柑橘素預(yù)處理;灌注結(jié)束后測定各組大鼠心肌乳酸脫氫酶含量、心肌梗死面積，測定心肌組織Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力。 結(jié)果 缺血再灌注損傷后，與模型組比較，柑橘素低、中、高劑量組乳酸脫氫酶含量下降（P < 0.05或P < 0.01），心肌梗死面積減?。≒ < 0.05或P < 0.01），心肌組織Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活力升高（P < 0.05）。 結(jié)論 柑橘素可能通過增強(qiáng)缺血/再灌注大鼠心肌的能量代謝，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 柑橘素;缺血/再灌注;能量代謝;大鼠

[中圖分類號(hào)] R542.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）12（b）-0022-04

ischemia/reperfusion in rats. Methods According to random number table method， 50 adult male Sprague-Dawley （SD） rats were divided into five groups （n = 10）： blank control group， modle group， and low， medium， high dose of naringenin group （5， 10， 20 μmol/L）. The heart of rat in each group was treated with 30 min global ischemia followed by 120 min reperfusion; the rats of low， medium， high dose of naringenin group were treated with 5， 10， 20 μmol/L of naringenin perfusion before ischemia; after reperfusion， the myocardial content of lactate dehydrogenates and myocardial infarct size in each group were examined， the activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in myocardial tissue were detected. Results After ischemia/reperfusion injury， compared with modle group， the contents of lactate dehydrogenates in low， medium， high dose of naringenin group were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， the myocardial infarct size was significantly reduced （P < 0.05 or P < 0.01）， the activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in myocardial tissue were significantly improved （P < 0.05）. Conclusion Narigenin palys a cardioprotective role may be through enhancing the myocardial energy metabolism of rats with ischemia/reperfusion.

[Key words] Naringenin; Ischemia/reperfusion; Energy metabolism; Rats

柑橘素，屬二氫黃酮類，存在于葡萄柚、檸檬、番茄等薔薇科、蕓香科植物的果實(shí)或者果皮中[1]。柑橘素具有多種生物學(xué)活性，目前報(bào)道的有抑制腫瘤細(xì)胞增殖[2]、抑制炎癥水平[3]、抗氧化[4]、降糖[5]、改善動(dòng)脈粥樣硬化[6]等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，柑橘素對大鼠的心肌損傷有保護(hù)作用[7]。本研究通過應(yīng)用大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的模型，探討柑橘素保護(hù)大鼠心臟缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制是否與能量代謝有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑

采用美國Sigma公司生產(chǎn)的柑橘素（生產(chǎn)批號(hào)：201 30503）。以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，溶解柑橘素，配成柑橘素母液，所需柑橘素濃度由灌流液（即K-H液：NaCl 118.3 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，NaHCO3 25 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L，pH為7.35～7.4）稀釋所成。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20130103）、ATP酶試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20140410）、考馬斯亮藍(lán)試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20110210）均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠50只，體重280～300 g，1月齡，正常大鼠生長環(huán)境喂養(yǎng)。河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（冀）2014-1-003。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)懷與使用指南（Publication revised 1996;National Institutes of Health，Bethesda，MD）》進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)程序均由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物使用委員會(huì)批準(zhǔn)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為五組：空白對照組、模型組和柑橘素低、中、高劑量組（5、10、20 μmol/L）。

1.3 缺血再灌注損傷模型制備

大鼠以戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，仰臥位固定，迅速開胸后取出心臟。將心臟置于氧飽和的4℃ K-H液中，剪開心包，將主動(dòng)脈接于Langendorff灌流裝置，以37℃氧飽和的K-H液進(jìn)行恒壓恒溫逆向灌流（灌流壓力為80 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa）。大鼠心臟經(jīng)K-H液灌流穩(wěn)定30 min后，給予30 min全心缺血，然后給予120 min再灌注處理;造模成功標(biāo)準(zhǔn)為缺血再灌注后，心肌舒縮功能出現(xiàn)障礙，形態(tài)上出現(xiàn)心肌梗死。

1.4 動(dòng)物分組與給藥

空白對照組大鼠只給予K-H液平衡灌流180 min;模型組大鼠給予K-H液平衡灌流30 min，缺血30 min，復(fù)灌120 min;柑橘素低、中、高劑量組大鼠心臟在缺血前分別給予5、10、20 μmol/L濃度的柑橘素液灌流10 min，再予缺血30 min，復(fù)灌120 min。

1.5 心臟流出液LDH含量測定

各組大鼠分別在復(fù)灌后60 min采集心臟冠脈流出液，應(yīng)用比色法，利用分光光度計(jì)，按照LDH試劑盒說明書操作。

1.6 ATP酶活力測定

灌流結(jié)束后，取部分心肌組織，生理鹽水洗凈血跡，制成勻漿，離心，取上清。采用定磷法，應(yīng)用分光光度計(jì)測定OD值，計(jì)算Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

1.7 心肌梗死面積（MIS）測定

灌流結(jié)束后，取下心臟，將心室切成均勻的5片。將其置于37℃的10% TTC溶液中避光孵育15 min，甲醛固定2 h。以數(shù)碼相機(jī)采集圖像，運(yùn)用ImageProPlus 7.0軟件圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。梗死區(qū)域呈蒼白色，MIS為梗死區(qū)占心室總面積的百分比。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柑橘素對冠脈流出液LDH的影響

缺血/再灌注60 min時(shí)，空白對照組冠脈流出液中的LDH明顯低于模型組（P < 0.01），柑橘素低、中、高劑量組冠脈流出液中LDH含量均顯著低于模型組（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

2.2 柑橘素預(yù)處理對MIS的影響

缺血再灌注120 min后，柑橘素低、中、高劑量組MIS均明顯低于模型組（P < 0.05或P < 0.01），且柑橘素中、高劑量組MIS明顯低于柑橘素低劑量組（P < 0.05）?？瞻讓φ战M未出現(xiàn)心肌梗死，不納入統(tǒng)計(jì)范圍。見表1。

2.3 柑橘素預(yù)處理對ATP酶活力的影響

缺血/再灌注后，模型組大鼠心肌組織Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力均較空白對照組顯著降低（P < 0.01）;柑橘素預(yù)處理可不同程度地影響ATP酶活力，與模型組比較，柑橘素低、中、高劑量組可升高Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

3 討論

Jennings等[8]發(fā)現(xiàn)犬的心臟嚴(yán)重缺血后恢復(fù)再灌注會(huì)加重心肌壞死的程度。這種心肌細(xì)胞因缺血而發(fā)生可逆性的損傷，恢復(fù)血供后會(huì)使損傷加重，引起細(xì)胞死亡或進(jìn)一步的功能障礙，稱之為缺血/再灌注損傷[9]。再灌注損傷后可引起心律失常[10]、心肌結(jié)構(gòu)改變[11]、心肌壞死，以及血流動(dòng)力學(xué)改變[12]。而MIS直接影響心功能的恢復(fù)及預(yù)后[13]。藥物預(yù)處理在心肌缺血前發(fā)揮作用，可以起到對抗心肌缺血/再灌注損傷的作用[14]。Subburaman等[15]研究發(fā)現(xiàn)，化療所致的心肌損傷大鼠模型中，柑橘素對心臟起保護(hù)作用。另有國外研究表明，在心腎綜合征大鼠模型中，柑橘素可以改善心室重構(gòu)和心功能，抑制氧化應(yīng)激[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，柑橘素預(yù)處理可以縮小大鼠缺血/再灌注損傷后的MIS，提示柑橘素預(yù)處理對心肌缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用，可以改善心室功能。

缺血/再灌注損傷后，心肌細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，大量細(xì)胞內(nèi)酶包括LDH、肌酸激酶（CK）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）彌散至細(xì)胞外，這些酶的增高代表心肌損傷的加重[17]。本研究通過測定缺血/再灌注后大鼠心肌組織中LDH活性，來檢測心肌細(xì)胞的損傷程度，結(jié)果顯示，柑橘素組冠脈流出液中的LDH含量較模型組降低。提示柑橘素可以穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜，保護(hù)受損傷的心肌。

缺血/再灌注損傷過程中，可發(fā)生氧自由基損傷、鈣離子超載、能量代謝障礙、炎癥介質(zhì)釋放等[18]。研究認(rèn)為，心肌缺血/再灌注損傷的起始環(huán)節(jié)是能量代謝障礙[19-21]。心肌組織中Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶存在于細(xì)胞膜上，是維持心肌細(xì)胞興奮傳導(dǎo)、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)[22]。當(dāng)心肌缺血發(fā)生時(shí)，能量代謝發(fā)生障礙，細(xì)胞內(nèi)ATP減少，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+積聚，K+、Mg2+流失[23]，造成細(xì)胞內(nèi)高鈣、低鉀血癥。細(xì)胞內(nèi)鈣超載會(huì)加重線粒體損傷，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終引起心肌細(xì)胞的能量缺乏，造成遲發(fā)性細(xì)胞死亡等[24-25]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活性顯著下降。而柑橘素低、中、高劑量組可以明顯提高心肌組織中的Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活性，并且具有劑量依賴性。提示柑橘素預(yù)處理可以通過調(diào)節(jié)大鼠心臟缺血/再灌注損傷后的離子失衡，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)能量代謝的恢復(fù)。

綜上所述，柑橘素對大鼠心臟缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用，其作用可能與減少M(fèi)IS、提高ATP酶活性、改善能量代謝有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-08-29 本文編輯：張瑜杰）