攜帶人VEGF165、Ang1基因的AAV—2促血管新生研究

蔡冠軍 譚最 章長杰

【摘要】 目的：通過觀測攜帶人血管內(nèi)皮生長因子-165（vascular endothelial growth factor，VEGF165）和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang1）基因的重組腺相關(guān)病毒-2（adeno-associated virus，AAV-2）對兔肌組織的生物學(xué)效應(yīng)，探討其促進(jìn)血管再生的能力。方法：選取雄性新西蘭大白兔32只，隨機(jī)分為四組，每組各8只。用攜帶人VEGF165基因的病毒載體AAV-2-hVEGF165、攜帶人Ang1基因的病毒載體AAV-2-hAng1、攜帶-半乳糖苷酶（-gal）基因的rAAV-2-LacZ同時(shí)攜帶人Ang1/VEGF165基因的病毒載體AAV-2-hAng1/VEGF165直接注射新西蘭雄性大白兔肌組織中，4周后利用肉眼觀察和免疫組織化學(xué)染色法檢測它們的血管再生效應(yīng)。結(jié)果：注射AAV-2-hAng1/VEGF165的肌組織內(nèi)再生的血管豐富密集且管徑粗大，明顯優(yōu)于AAV-2-hVEGF165、AAV-2-hAng1、AAV-2-LacZ的血管再生效應(yīng)。結(jié)論：同時(shí)攜帶人Ang1、VEGF16兩種基因的AAV-2在肌組織中發(fā)揮最強(qiáng)的血管再生效應(yīng)，單獨(dú)攜帶人Ang1、VEGF16兩種基因的AAV-2在肌組織也具有促進(jìn)血管再生效應(yīng)。AAV-2-hAng1/VEGF165不但可促進(jìn)缺血肢體的血管生成、動(dòng)脈生成、血流量的恢復(fù)，并且可降低血管的通透性，其療效優(yōu)于

AAV-2-hVEGF165、AAV-2- hAng1、AAV-2-LacZ的單獨(dú)應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 血管生成素1； 血管內(nèi)皮生長因子； 腺相關(guān)病毒； 血管新生

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.28.004

隨著社會(huì)人口老齡化的發(fā)展，缺血性血管疾病日益增多，已經(jīng)成為威脅人類的主要疾病之一，其治療最終要靠血管的再生。VEGF165是一種強(qiáng)烈的有絲分裂素，也是一種分泌性分子，以可溶性調(diào)節(jié)物的形式調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的生長和血管形成，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)新生血管生成[1-5]。Ang1是新近發(fā)現(xiàn)的與血管生長密切相關(guān)的生物因子[6]，對血管內(nèi)皮細(xì)胞有特異性作用，可誘導(dǎo)血管芽生，對內(nèi)皮細(xì)胞有很重要的化學(xué)趨化反應(yīng)及血管網(wǎng)狀形成作用[7]，通過多種途徑來維持血管的穩(wěn)定性和完整性，是特異的血管生成正調(diào)節(jié)因子。本研究將同時(shí)攜帶人VEGF165、Ang1基因的重組腺相關(guān)病毒直接注射到新西蘭雄性大白兔下肢肌組織中，對比單獨(dú)應(yīng)用，探討其是否可提高促血管再生能力。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒phVEGF165、質(zhì)粒phAng1、質(zhì)粒phAV、質(zhì)粒ph-LacZ、（有前期構(gòu)建）AAV-Helper-Free System、感受態(tài)細(xì)胞Top10F、HEK293細(xì)胞株、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、磷酸鈣法細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒、平滑肌肌動(dòng)蛋白（-SMA）一抗（DAKO）。

1.2 方法

1.2.1 rAAV載體的制備 pAAV-Ang1，pAAV-Helper，pAAV-RC，各2 g用磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用氯仿處理-PEG/NaCL沉淀-氯仿抽提法，此即得到初步濃縮純化病毒AAV-2-hAng1[8]。同此方法制備AAV-2-hVEGF165、AAV-2-hAng1/VEGF165、AAV-2-LacZ。

1.2.2 AAV-2病毒的高濃縮純化 將制備的病毒AAV-2-hAng1、AAV-2-hVEGF165、AAV-2-hAng1/VEGF165、AAV-2-LacZ用centriplus YM-100的超濾管進(jìn)行濃縮純化。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 選取月齡為5～7個(gè)月，雄性新西蘭大白兔32只，體重2.0～2.5 kg，將它們分成四組，分組如下：（1）攜帶人VEGF165基因的病毒載體處理組（AAV-2-hVEGF165組）；（2）攜帶人Ang1基因的病毒載體處理組（AAV-2-hAng1組）；（3）攜帶-半乳糖苷酶（-gal）基因的處理組（rAAV-2-LacZ組）；（4）攜帶人Ang1/VEGF165基因的病毒載體處理組（AAV-2-hAng1/VEGF165），每組8只。對AAV-2-hAng1組，在每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右上肢注射AAV-2-hAng1，2 mL。對AAV-2-hAng1/VEGF165組，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右下肢注射AAV-2-hAng1/VEGF165，2 mL。rAAV-2-LacZ組對每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左上肢注射AAV-2-LacZ，2 mL。對AAV-2-hVEGF165組每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左下肢注射AAV-2-hVEGF165，2 mL。注射部位用無損傷絲線縫扎肌膜做標(biāo)記。

1.2.4 肉眼觀察 注射AAV-2病毒4周后，將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用氯氨酮按2 mg/kg進(jìn)行肌肉注射麻醉后，取結(jié)扎絲線處切開皮膚及皮下組織，對比觀察攜帶不同基因的4種AAV-2病毒對缺血肢體血管再生效應(yīng)。

1.2.5 組織學(xué)檢測 將麻醉的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取絲線結(jié)扎標(biāo)記的肌組織，冰凍切片，厚度7 m，利用針對-SMA的一抗進(jìn)行免疫組化染色，隨機(jī)選取30個(gè)視野計(jì)數(shù)-SMA陽性的血管密度（-SMA陽性血管數(shù)/mm2）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，組間參數(shù)的比較采用單向方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察4種AAV-2病毒分別對缺血肢體血管再生效應(yīng) AAV-2肌注實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周后，依次循絲線縫扎處切開皮膚肉眼直視下觀察注射帶有不同基因的4種不同病毒的血管再生效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射同時(shí)攜帶有人hAng1/VEGF165基因的病毒其再生血管豐富密集且管徑粗大，攜帶有人VEGF165基因的病毒再生血管稀疏且周圍組織水腫明顯，攜帶有人Ang1基因的病毒再生血管稀少，攜帶有人LacZ基因的病毒幾乎無再生血管，見圖1。

2.2 組織學(xué)檢測血管再生效應(yīng) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周后肌組織切片經(jīng)-SMA免疫組化染色，可見血管平滑肌染成了棕色如圖2所示。-SMA陽性血管密度計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)AAV-2-hAng1/VEGF165組為（9.8±5.2）個(gè)/mm2組明顯高于AAV-2-hVEGF165組（6.2±3.0）個(gè)/mm2、AAV-2-hAng1組（5.1±2.1）個(gè)/mm2（t=4.21、5.96，P<0.05）、AAV-2-LacZ組（1.8±0.2）個(gè)/mm2（t=11.46，P<0.05）；AAV-2-hVEGF165組、AAV-2-hAng1組-SMA陽性血管密度計(jì)數(shù)均高于AAV-2-LacZ組（t=6.35、4.98，P<0.05）。

3 討論

隨著人民生活條件的好轉(zhuǎn)，飲食結(jié)構(gòu)的改變，人均壽命的延長等社會(huì)人口老年化的發(fā)展，使得缺血性血管疾病如冠心病，動(dòng)脈硬化閉塞癥，糖尿病足、血栓閉塞性脈管炎等為代表的疾病日益增多，嚴(yán)重影響人民的生活質(zhì)量，部分還威脅到生命。文獻(xiàn)[9]記載，在我國動(dòng)脈缺血性疾病其總發(fā)病率為0.74%，是血管外科常見病。目前外科治療對于廣泛的動(dòng)脈狹窄和閉塞病癥沒有很好的療效，隨著對缺血性疾病的深入研究，以及分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的進(jìn)展，基因治療在血管疾病治療中是備受矚目的新方法，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)刺激缺血部位生長新生血管成為治療缺血性血管疾病的一種主要措施[10]。

目前對于嚴(yán)重缺血性疾病的基因治療，是使用病毒載體、非病毒載體或質(zhì)粒載體將VEGF直接轉(zhuǎn)染到缺血組織中或注射到血管內(nèi)，利用細(xì)胞旁分泌VEGF的途徑，促進(jìn)病變部位側(cè)支血管的建立[11-20]。

本研究用攜帶人VEGF165基因的病毒載體AAV-2-hVEGF165，攜帶人Ang1基因的病毒載體AAV-2-hAng1，攜帶-半乳糖苷酶（-gal）基因的rAAV-2-LacZ和同時(shí)攜帶人Ang1/VEGF165基因的病毒載體AAV-2-hAng1/VEGF165直接注射新西蘭雄性大白兔缺血的四肢肌組織中，4周后利用肉眼觀察和免疫組織化學(xué)法檢測它們之間的血管再生效應(yīng)。從本實(shí)驗(yàn)可以看出同時(shí)攜帶兩種基因AAV-2在肌組織中高效表達(dá)，發(fā)揮最強(qiáng)的血管再生效應(yīng)，單獨(dú)攜帶人Ang1、VEGF16兩種基因的AAV-2在肌組織也具有促進(jìn)血管再生效應(yīng)。因此，hAng1/VEGF165可協(xié)同性地促進(jìn)缺血肢體的血管生成、動(dòng)脈生成、血流量的恢復(fù)，并可能具有改變血管通透性的作用，其可能作為血管再生相關(guān)疾病的新的治療方法，具有潛在的廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2018-07-09） （本文編輯：周亞杰）