IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)在裸鼠繁育中的應(yīng)用及其效果分析*

劉勇 趙龍 張凡 柏合

【摘要】 目的：探究在裸鼠繁育中應(yīng)用IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)的效果。方法：自2016年6月從本校醫(yī)藥研究中心SPF級動物室中，選擇一間約20 m2的房間，在無特殊病原微生物（SPF）屏障系統(tǒng)的基礎(chǔ)上安裝IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)，作為研究組；另選擇相同大小的房間，僅安裝SPF屏障系統(tǒng)，作為對照組。研究起始，對照組與研究組都放置6只雌鼠（nu/+）與6只雄鼠（nu/nu），按照雌雄比1︰1的比例合籠。截止到2017年12月，統(tǒng)計兩組的分娩間隔、平均每胎產(chǎn)仔數(shù)、存活率。結(jié)果：兩組的分娩間隔、平均每胎產(chǎn)仔數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；研究組的存活率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：在裸鼠的繁育過程中應(yīng)用IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)，能夠顯著提升裸鼠的存活率，從而能為臨床動物實驗提供更多優(yōu)質(zhì)可用的實驗動物。

【關(guān)鍵詞】 裸鼠； SPF屏障系統(tǒng)； IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)； 分娩間隔； 存活率

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.29.007

作為一種存在先天性免疫缺陷的實驗動物，裸鼠的免疫力低下是由于T細胞的缺失所造成的。裸鼠需要在無特殊病原微生物（specific pathogen free，SPF）級以上的環(huán)境中生長。管理中稍有不慎就會導(dǎo)致種群的死亡與污染[1]。正因為如此，裸鼠的繁育飼養(yǎng)成為困擾研究人員的重大問題。裸鼠最重要的三個特征是無毛（hairless）、無胸腺（athymus）和裸體（Naked）。原種的裸鼠表現(xiàn)出無鼻毛的特征，足尖常常處于收縮的狀態(tài)、螺旋樣畸形。性成熟的雌性裸鼠沒有規(guī)律的發(fā)情周期，卵巢比較小，注射hCG后無法促進其排卵。除了雌性裸鼠在生殖方面有缺陷外，雄性裸鼠經(jīng)常產(chǎn)生畸形的精子，活動力低下，因此原種裸鼠的生育力極低[2]。新生的裸鼠剛開始的生長速度和正常小鼠沒有明顯差異，但在3周后，約是離乳的時間，裸鼠的生長速度顯著遲緩，普遍表現(xiàn)出肝臟疾病，死亡率較高，平均壽命在14～25周。經(jīng)過優(yōu)化育種后的遠交系無胸腺裸體小鼠在外形上看，與原種一致，全身接近于無毛，有時可在裸鼠的背部見到稀疏的帶狀毛，皮薄、褶皺較多[3]。為提高裸鼠的存活率、純合裸鼠（nu/nu）的獲得率，本研究中心引入獨立送風(fēng)系統(tǒng)（individual ventilated cages，IVC），探究獨立送風(fēng)系統(tǒng)在裸鼠繁育中的應(yīng)用，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2016年6月本校醫(yī)藥研究中心從北京實驗動物研究所購入12只雌鼠（nu/+）、12只雄鼠（nu/nu），所選種鼠均為8周大。研究起始，對照組與研究組都放置6只雌鼠（nu/+）與6只雄鼠（nu/nu），按照雌雄比1︰1的比例合籠。

1.2 方法 從本校醫(yī)藥研究中心SPF級動物室中，選擇一間約20 m2的房間，在SPF屏障系統(tǒng)的基礎(chǔ)上安裝IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)，作為研究組；另選擇相同大小的房間，僅安裝SPF屏障系統(tǒng)，作為對照組。

1.2.1 獨立送風(fēng)系統(tǒng)的安裝與使用 研究組所使用的獨立送風(fēng)系統(tǒng)購自蘇州市猴皇動物實驗設(shè)備科技有限公司，產(chǎn)品型號為MKS-112，廠家安排專業(yè)的工人上門安裝。裸鼠放置在配套使用的過濾帽鼠盒與層流柜。IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)的良好運行，關(guān)鍵在于送、排風(fēng)系統(tǒng)的設(shè)計與安裝。以國外先進設(shè)備為基礎(chǔ)，將動物福利考慮在內(nèi)，IVC籠盒內(nèi)的空氣流向應(yīng)該使得過濾凈化后的空氣均勻平穩(wěn)的分布在內(nèi)，構(gòu)成正壓風(fēng)幕，避免過強氣流的產(chǎn)生。

1.2.2 裸鼠的飼養(yǎng) （1）兩組室溫變化范圍控制在21～25 ℃。照明時間統(tǒng)一設(shè)定為光照12 h，黑暗12 h?？諝庵械南鄬穸瓤刂?0%～50%。（2）按照由低至高的不同級別設(shè)定空氣凈化與過濾裝置，三組空調(diào)交替完成過濾的任務(wù)[4]。（3）所用的生長繁殖飼料購買自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。飼料原料有豆渣、魚粉、啤酒酵母粉、植物油、玉米、小麥、麥麩、磷酸氫鈣、石粉、鐵、銅、錳、鋅、維生素A、維生素D、維生素E、維生素B1、泛酸等。最終飼料中各種營養(yǎng)物質(zhì)的終濃度為：水分10%，粗蛋白23.59%，粗纖維2.1%，粗脂肪5.01%，粗灰分7.68%等。飼料買來之后，由于裸鼠過于低下的免疫力，需要對其進行放射的滅菌處理（Co60）。自由攝入，定期添補。每周可適量添加熟雞蛋黃、生瓜子[5]。（4）飲用水經(jīng)過凈水器（四季沐歌MU-Q01凈水機）處理后，用鹽酸將pH值調(diào)至3.5左右，并在水中加入適量的濃縮魚肝油粉（武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)）。自由攝入，定期添補。（5）每周更換一次墊料。

1.2.3 飼養(yǎng)注意事項 研究人員進入鼠房內(nèi)，應(yīng)穿著滅菌后的實驗服，并佩戴無菌口罩、帽子、乳膠手套。

1.2.4 飼養(yǎng)記錄 裸鼠到達研究中心時即建立表格，將籠號詳細的記錄清楚，便于后續(xù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.3 觀察指標(biāo) 每日上午9點至10點觀察裸鼠繁育情況。從每只雌鼠生下第一窩仔鼠開始記錄，截止到2017年12月底，統(tǒng)計兩組的分娩間隔、平均每胎產(chǎn)仔數(shù)，以及統(tǒng)計8周后的存活率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

對照組的分娩間隔為（41.2±2.7）d，研究組為（43.7±2.8）d，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.986，P=0.064）。對照組平均每胎產(chǎn)（7.8±1.4）只，研究組平均每胎產(chǎn)（7.9±2.8）只，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.012，P=0.071）。仔鼠出生8周即性成熟后，對仍健在的新生裸鼠數(shù)進行統(tǒng)計分析，對照組的存活率為（76.9±3.4）%，顯著低于研究組的（86.4±1.7）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-6.122，P<0.001）。

3 討論

20世紀60年代，在英國的一家醫(yī)院里，一位醫(yī)生無意間在非近交系小鼠中發(fā)現(xiàn)幾只沒有毛發(fā)包被的小鼠。同年代，有學(xué)者證明了這種沒有毛發(fā)的小鼠的產(chǎn)生是由于染色體上的等位基因突變所造成的[6]。對這種小鼠的皮膚組織與正常小鼠的皮膚進行組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)有異常，經(jīng)證明是常染色體退化導(dǎo)致的，因此得名“裸體（Nude）”，“nu”是其突變的基因符號，可惜當(dāng)時沒有引起大眾的注意[7]。此后，當(dāng)研究人員發(fā)現(xiàn)裸鼠不具有胸腺，這才吸引了醫(yī)學(xué)與生物學(xué)相關(guān)的研究人員的關(guān)注。在裸鼠被發(fā)現(xiàn)之前，用動物模型去進行免疫學(xué)的研究，一般選擇的是給小鼠注射抑制T細胞的藥物，或者是手術(shù)摘除胸腺。由于藥物對T細胞的抑制作用不完全，手術(shù)的副作用過多，關(guān)于免疫學(xué)的研究進展處于一個緩慢前進的狀態(tài)。而裸鼠的發(fā)現(xiàn)，為免疫學(xué)的研究與進展提供了一個理想的實驗動物模型[8]。

因為裸鼠原種過于低下的免疫力，壽命短，生育率也較低，無法大規(guī)模的應(yīng)用于實際的研究工作。目前在裸鼠的繁育過程中不用nu/nu雌鼠，因其繁殖性能低，一般采用雜合子交配方式或隱性純合子雄性與雜合子雌鼠交配。這種交配方法，其后代將出現(xiàn)表現(xiàn)型正常的仔鼠和裸鼠，比例為1︰1。為了改良這些缺點，人們將原種裸鼠與其他種群的小鼠雜交，一代代繁育，最終獲得了壽命較長、生育率好、免疫力能耐受SPF的遠交系無胸腺裸體小鼠，得以廣泛應(yīng)用[9]。

因為沒有T細胞維持免疫力，繁育裸鼠所用的飼料、所處環(huán)境要求條件較為嚴格。國外的研究人員經(jīng)過多年的繁育，得出了一定的經(jīng)驗。裸鼠的繁育條件采用無特定病原體（SPF）級，飼養(yǎng)條件選定為屏障系統(tǒng)或隔離系統(tǒng)[10]。但是一些發(fā)生在裸鼠中的傳染性疾病也有所報道。各國根據(jù)自己的實際需要，在自身條件的基礎(chǔ)上建立了相應(yīng)的質(zhì)量控制方法，大力促進了裸鼠繁育工作和以裸鼠為實驗動物的其他相關(guān)學(xué)科的飛速發(fā)展[11]。

裸鼠的淋巴細胞與正常的淋巴細胞狀態(tài)不同，由于胸腺的異常，進而引發(fā)T細胞由無活性的狀態(tài)到有活性的轉(zhuǎn)變出現(xiàn)障礙[12]。雖然B細胞、T細胞的前體是正常的，由于胸腺不存在，因此無形成有功能的正常的T細胞[13]。因為不存在胸腺，裸鼠的免疫反應(yīng)是不完整的、異常的，是一種免疫缺陷動物。胸腺分布于健全的小鼠的胸骨柄的后方，毗鄰氣管、位于心臟的腹面，胸腺分左右兩葉，外形呈現(xiàn)乳白色脂肪狀。機體免疫功能的正常與否，與胸腺有著密切的關(guān)系，有研究可以證明，胸腺能夠分泌多種表現(xiàn)出生物活性的多肽類物質(zhì)，統(tǒng)稱為胸腺素[14]。胸腺素能夠促使淋巴組織增殖分化形成新的淋巴細胞；胸腺素已被證實同機體免疫技能有密切的關(guān)系，能夠促進來自其他組織的原始淋巴細胞轉(zhuǎn)變成有免疫活性的T淋巴細胞，進而發(fā)揮免疫功能。

為了防止基因突變以恢復(fù)裸鼠的免疫功能，常在裸鼠中應(yīng)用多種免疫學(xué)檢測方法來證明其T淋巴細胞處于缺陷的狀態(tài)[15]。例如，使用羊紅細胞或者是地鼠的紅細胞反復(fù)免疫，T淋巴細胞的免疫功能沒有得到恢復(fù)，如果再用三硝基苯基修飾過的上述兩種紅細胞進一步免疫，裸鼠體內(nèi)沒有產(chǎn)生三硝基抗體，則證明還是原來的裸鼠。除了應(yīng)用紅細胞進行驗證，用狂犬活疫苗對裸鼠與正常小鼠進行驗證，關(guān)于血清中抗體的產(chǎn)生、或者是抗體本身的功能，裸鼠與正常小鼠呈現(xiàn)出不一樣的趨勢，通過該種處理的正常小鼠能表現(xiàn)出良好的免疫功能，而裸鼠無法產(chǎn)生可被檢測到的免疫反應(yīng)[16]。

IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)，是應(yīng)用于小型嚙齒類實驗動物飼養(yǎng)的新一代SPF級、凈化通氣的飼養(yǎng)裝備，可以取代傳統(tǒng)實驗動物飼養(yǎng)的屏障、凈化系統(tǒng)。近些年來在國內(nèi)許多以小型嚙齒類動物為研究對象的研究室，IVC的應(yīng)用越來越廣泛。這種在SPF級別上加裝的空氣凈化設(shè)備，即不同于過去那種完全的屏障，也不同于開放環(huán)境下的IVC安裝。與單純的SPF級屏障系統(tǒng)做比較，三級凈化空調(diào)機組耗電量降低，由于IVC系統(tǒng)本身運行所需要的耗電量很低，因此IVC的應(yīng)用能夠節(jié)省運營成本[17]?？諝膺M入IVC系統(tǒng)前，經(jīng)過了三級空調(diào)凈化后，又經(jīng)過了IVC主機與各個籠盒的凈化，裸鼠所呼吸到的空氣處于一個相對潔凈的狀態(tài)。由于進入IVC系統(tǒng)之前，空氣已經(jīng)被過濾，這樣的操作能夠在一定程度長延長IVC系統(tǒng)的使用壽命與效率。這樣，既能保證了裸鼠生長繁殖的微環(huán)境處于SPF狀態(tài)，也能防止裸鼠之間相互傳染疾病，同時對研究人員的身體健康起到了保護的作用。由于裸鼠沒有毛發(fā)進行包被與保護，其適于裸體小鼠的室溫為26～28 ℃（78～820 F），

其散失體溫較有毛小鼠為快。處于連續(xù)空氣層流中，它們的散熱更快，需要大約28 ℃（800 F）的室溫予以補償。一般飼料室內(nèi)溫度控制在（25±1）℃也可以。如果裸鼠和有毛雜合子鼠同籠飼養(yǎng)時室溫可略低一點。飼料在連續(xù)空氣層流室中的裸鼠需要將層流室內(nèi)溫度提高到28 ℃。相對濕度應(yīng)保持在40%～60%，此時，成年裸體小鼠皮膚水分散失最少。濕度過低，對新生裸鼠生存不利，這在空氣層流環(huán)境中尤為重要。

IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)的良好運行，關(guān)鍵在于送、排風(fēng)系統(tǒng)的設(shè)計與安裝。以國外先進設(shè)備為基礎(chǔ)，將動物福利考慮在內(nèi)，IVC籠盒內(nèi)的空氣流向應(yīng)該使得過濾凈化后的空氣均勻平穩(wěn)的分布在內(nèi)，構(gòu)成正壓風(fēng)幕，避免過強氣流的產(chǎn)生[18]。要防止籠盒內(nèi)的裸鼠特別是新生的仔鼠，由于風(fēng)速過大、通風(fēng)過度而出現(xiàn)脫水的現(xiàn)象，與其他普通小鼠相比，沒有毛發(fā)包裹的裸鼠更容易脫水致死。除了籠盒上部的氣流，籠盒下部也應(yīng)該有均勻穩(wěn)定的氣流通過，以使得墊料處于干燥的狀態(tài)，將裸鼠代謝產(chǎn)生的異位一并排出。送、排風(fēng)系統(tǒng)的設(shè)計需要適用于整體（小于

5 kPa）或分體式獨立通風(fēng)籠具的設(shè)計與制作[19]。

經(jīng)過改良育種后的遠交系無胸腺裸鼠，依據(jù)有無IVC分為研究組與對照組。對照組的分娩間隔（41.2±2.7）d與研究組（43.7±2.8）d比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而對照組平均每胎產(chǎn)仔數(shù)為（7.8±1.4）只，研究組為（7.9±2.8）只，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），這說明在裸鼠繁育中應(yīng)用IVC系統(tǒng)對其生育能力沒有顯著影響。新生的仔鼠出生8周即性成熟后，對照組的存活率為（76.9±3.4）%，顯著低于研究組的（86.4±1.7）%（P<0.05）。

綜上所述，在裸鼠繁育的過程中，應(yīng)用IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)，對裸鼠的生育能力沒有影響的同時還能夠顯著性的提升新生仔鼠的存活率，使擴群的速度與質(zhì)量得到有效的保證，為下一步進行免疫學(xué)方面的研究或者是構(gòu)建多種人惡性腫瘤的模型奠定了堅實的基礎(chǔ)，在臨床研究中具有較大的應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2018-06-06） （本文編輯：張爽）