助陽開郁方對抑郁癥大鼠海馬BDNF表達及其胞內(nèi)信號轉導通路的影響

馮振宇，趙 杰，馬小娟，王虹娟，陳佳麗

（山西中醫(yī)學院中西醫(yī)結合醫(yī)院，山西太原030013）

抑郁癥是一種嚴重危害人類身心健康的精神疾病，其終生患病率高達15%～20%，并且呈慢性及反復發(fā)作性等特點，嚴重影響患者的生活質(zhì)量［1-2］。目前，關于抑郁癥的發(fā)病機制尚未完全闡明。大量研究證實，海馬神經(jīng)突觸結構損傷和神經(jīng)元再生障礙等神經(jīng)可塑性的改變是抑郁癥發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）在神經(jīng)元的生長與突觸的形成方面起到了重要作用，具有調(diào)控神經(jīng)突觸可塑性的效應，在抑郁癥發(fā)生與病理過程中的作用已得到了廣泛關注。海馬內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）-cAMP反應元件結合蛋白（CREB）通路-腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）信號通路是BDNF調(diào)控海馬神經(jīng)元可塑性的重要胞內(nèi)轉導機制［3］。目前，調(diào)節(jié)誘導海馬BDNF及其信號轉導通路，已經(jīng)成為抗抑郁藥物研究和開發(fā)的一個熱點。

助陽開郁方由“甘麥大棗湯”合清末鄭欽安的“補坎益離丹”加減化裁而成，其作為臨床驗方應用于抑郁癥已有十余年，在前期的臨床療效評價研究中發(fā)現(xiàn)，本方可以通過調(diào)整抑郁癥患者5-羥色胺、去甲腎上腺素水平干預陽虛型抑郁癥患者神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)揮治療作用。課題組通過建立應激抑郁動物模型，觀察到本方能夠有效改善抑郁癥大鼠行為學表現(xiàn)，并對調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)可塑性具有一定的作用。本研究選擇BDNF及其關鍵的胞內(nèi)信號轉導通路cAMP-CREB-BDNF通路進行研究，以期進一步探討助陽開郁方抗應激抑郁的作用機制。

1 實驗與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥物 助陽開郁方由炮附子15 g，蛤粉 20 g，牡蠣 30 g，桂枝 15 g，砂仁 10 g，炒黃柏10 g，茯苓20 g，炙甘草10 g組成，飲片購自山西中西醫(yī)結合醫(yī)院藥房。按原方比例稱取藥材，先浸泡30 min，附子單獨浸泡并先煎60 min再與其余藥物共煎20 min，反復煎煮3次，混合藥汁，至稠膏狀，60℃烘干制成干膏并粉碎成細粉，過80目篩。鹽酸氟西汀分散片（西班牙禮來公司，批號：A496002，規(guī)格20 mg/片），助陽開郁方各劑量與鹽酸氟西汀根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算配制成濃縮水溶液備用。

1.1.2 動物 無特定病原體SPF級雄性Wistar大鼠共 36 只，初始體重（165±15）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［許可證號：SCXK（京）2012-0024］。

1.1.3 主要試劑 cAMP ELISA檢測試劑盒（Elabscince 公司，批號：AK0015AUK18），組織 RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物有限公司，批號202366AX），DNA逆轉錄試劑（北京艾德萊生物有限公司，批號267258AH），PCR擴增試劑（北京艾德萊生物有限公司，批號272632AX），內(nèi)參βactin、CREB、BDNFmRNA特異性引物（武漢金開瑞生物工程有限公司設計）。

1.1.4 主要儀器 7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），Synergy 4多功能微孔板檢測儀（美國BioTek公司），Tc-xP基因擴增儀（杭州博日科技有限公司），Scandrop 250超微量分光光度計（德國耶拿公司），JXFSTRP-24全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司），1316型生物安全柜（美國Thermo公司），MB-102恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆?，F(xiàn)resco17高速冷凍離心機（美國Thermo公司）。

1.2 方 法

1.2.1 動物分組 將36只大鼠適應性飼養(yǎng)7 d，然后按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、助陽開郁方高、中、低劑量組，氟西汀組，每組6只。

1.2.2 造模及給藥 參照文獻方法［5］除正常組外，其余各組大鼠均給予慢性不可預知溫和刺激刺激（CUMS）結合孤養(yǎng)造模，具體方法為：選用夾尾（1 min）、閃光（1 h）、噪音（1 h）、冰水游泳（4 ℃，5 min）、傾斜籠具（30 °，24 h）、潮濕墊料（100 mL，24 h）、晝夜顛倒、禁水、禁食9種溫和刺激，于每日9：00和16：00隨機安排刺激2次，連續(xù)刺激28 d。在造模的同時，空白組和模型組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，助陽開郁方高、中、低劑量組分別灌胃助陽開郁方濃縮煎劑（劑量分別相當于生藥11.7 g/kg、23.4 g/kg、46.8 g/kg），氟西汀組灌胃鹽酸氟西?。?.8 mg/kg），每只大鼠灌胃容量為0.2 mL/10 g，連續(xù)灌胃 28 d。

1.2.3 樣本采集 于實驗第29 d，采用3%戊巴比妥鈉2 mL腹腔注射麻醉大鼠，然后斷頭處死，冰盤上迅速分離海馬組織并置于液氮保存。

1.2.4 ELISA法檢測大鼠海馬cAMP含量 將海馬組織于2℃～8℃復溫，加入2 mL預冷的PBS緩沖液（pH 7.4），用自動研磨儀在液氮中研磨制作成勻漿，勻漿液以3 000 r/min低溫離心20 min，收集上清，采用ELISA方法檢測海馬cAMP含量，檢測過程中嚴格按照檢測試劑盒的說明操作。

1.2.5 RT-PCR法檢測海馬組織CREB與BDNF mRNA的表達 用自動快速研磨儀將海馬組織在液氮中研磨制作成組織勻漿。采用EASY spin Plus組織RNA快速提取試劑盒，按照其說明書提取總RNA并在液氮保存；采用紫外分光光度儀測定總RNA濃度與A 260/A280的比值，比值在1.8～2.0之間方可進行下一步實驗；每樣取總RNA 1.5 μg與 Oligo（dT）18引物溶液 1 μL、5RT Reaction Mix 4 μL、TRuE script H-R Tase/RI 1 μL 混合合成cDNA，加入RNase free water定容到總體積20 μL，混勻后離心，42℃孵育40 min，85℃孵育5 min以失活TRuE script H-R Tase，放入4℃冰箱待擴增；建立以下擴增反應體系：2 SYBR qPCR Mix 12.5 μL、DNA Template 1 μL、Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL、Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，用 RNase free water定容到 25 μL；設置PCR 循環(huán)條件：94℃、3 min→94℃、10 s→60℃、34 s，共40個循環(huán)，以DEPC無菌水代替cDNA模板作為陰性對照，每樣品 3個復孔，在每個循環(huán)延伸階段收集熒光信號，分析融解曲線；制備1.5%的瓊脂糖凝膠（含EB 1 g/L），取擴增后樣品5 μL加入 1 μL的 6×Loading buffer混勻，然后加入點樣孔，設定電泳條件為180 v，10 min開始電泳，電泳結束后在紫外透射模式下觀察RNA電泳結果并拍照。熒光定量PCR結果首先分析溶解曲線，各樣本的峰值基本一致，無雜峰信號，表示產(chǎn)物特異度高，以β-actin為內(nèi)參，通過計算倍數(shù)變化2-ΔΔCt值，對目的基因進行相對定量分析，比較各組差異。PCR引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，多組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls（SNK）-q 檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 助陽開郁方對抑郁癥大鼠海馬組織cAMP含量的影響

與正常組比較，模型組海馬cAMP含量顯著減低（P＜0.05）；與模型組比較，助陽開郁方高劑量組、氟西汀組海馬cAMP含量顯著增加（P＜0.05），助陽開郁方中劑量組和低劑量組海馬cAMP含量也呈下降趨勢且呈量效關系，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；助陽開郁方高劑量組海馬cAMP含量與氟西汀組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表見2。

表2 助陽開郁方對抑郁癥大鼠海馬組織cAMP含量的影響 （±s）

表2 助陽開郁方對抑郁癥大鼠海馬組織cAMP含量的影響 （±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

助陽開郁方組 6氟西汀組 6 11.7 2.65±1.26 23.4 5.52±1.42 46.8 6.46±2.862）3.33×10-3 6.79±3.372）F 7.26 P＜0.01

2.2 助陽開郁方對抑郁癥大鼠海馬組織CREB mRNA、BDNF mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組滑膜組織中CREB、BDNF mRNA 表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，助陽開郁方高劑量組和氟西汀組大鼠海馬組織CREB、BDNF mRNA表達明顯增高（P＜0.05）；與氟西汀組比較，助陽開郁方高劑量組CREB、BDNF mRNA表達較低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表 3、圖1。

表3 助陽開郁方對抑郁癥大鼠海馬組織BDNF、CREB mRNA表達的影響 （±s）

表3 助陽開郁方對抑郁癥大鼠海馬組織BDNF、CREB mRNA表達的影響 （±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05

組別 n 給藥劑量（g/kg） CREB mRNA BDNF mRNA正常組 6 - 12.57±1.16 15.42±3.29模型組 6 - 6.03±1.462） 8.50±3.571）助陽開郁方組 6氟西汀組 6 11.7 7.99±2.03 10.52±3.32 23.4 9.18±2.74 11.27±6.60 46.8 10.96±3.023） 13.81±3.803）3.33×10-3 11.67±2.853） 14.72±2.633）F 6.76 2.64 P＜0.01 ＜0.05

圖1 助陽開郁方對抑郁癥大鼠海馬組織CREB、BDNF mRNA表達的影響

3 討論

抑郁癥是一種以心境低落為主要特征的綜合征［5］，有關抑郁癥的發(fā)病機理至今尚未闡明，隨著醫(yī)學研究的不斷深入，目前認為長期慢性應激是促發(fā)抑郁的重要因素［6］，大腦海馬區(qū)是神經(jīng)發(fā)生的主要結構，負責學習和記憶，慢性應激是引起海馬結構損害和功能變化的重要因素［7］，海馬神經(jīng)突觸結構損傷和神經(jīng)元再生障礙等神經(jīng)可塑性的改變可能是抑郁癥發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)之一［8］。

BDNF作為一種具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)，在神經(jīng)元生存、生長以及突觸的形成等方面起到了重要的作用，具備調(diào)控神經(jīng)可塑性效應，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其中以海馬和皮質(zhì)中含量最高，BDNF的異常表達在抑郁癥發(fā)病中的作用已獲得廣泛關注，而BDNF表達的增加有利于神經(jīng)元的生存和形成，改善海馬神經(jīng)突觸可塑性，這一機制被認為是各種抗抑郁劑治療的共同作用途徑［9］。BDNF調(diào)控海馬神經(jīng)元可塑性胞內(nèi)轉導機制為：AC將三磷酸腺苷轉化為cAMP，cAMP激活蛋白激酶，并將CREB磷酸化，CREB-CRE結合，BDNF的啟動子區(qū)內(nèi)含CRE序列，受到CREB的調(diào)控，CREB磷酸化可增加體內(nèi)BDNF的表達，BDNF與其受體TrkB結合后使細胞中的突觸囊空泡素（SYN）、突觸素Ⅰ、抗凋亡因子（BCL-2）及鈣結合蛋白表達上升，SYNA和突觸素Ⅰ可增強海馬神經(jīng)突觸成熟及可塑性，BCL-2可降低海馬神經(jīng)元萎縮和凋亡［13］。長期的抗抑郁治療可以上調(diào)cAMP-CERB通路［10］，然后進一步介導BDNF的功能增強［14］，通過給予cAMP降解酶磷酸二酯酶抑制劑2 w，可以使cAMP水平增加，調(diào)節(jié)cAMPCERB功能，增加海馬組織磷酸化CERB（p-CERB）水平及BDNF的表達，促進神經(jīng)元發(fā)生，此類藥物抗抑郁作用已經(jīng)得到廣泛的證實［12］。

抑郁癥主要表現(xiàn)為情緒低落、思維遲緩、主動性下降等，中醫(yī)辨證機體陽氣不足或陽氣郁結，素體陽虛，或心、肝、脾、腎諸臟陽虛，陽虛升之不及，抑郁由此而生，溫陽法治療抑郁癥切合抑郁癥之病機，助陽開郁方可溫腎暖脾，助陽舒肝，在治療抑郁癥方面有良效。本研究在前期研究成果的基礎上進一步觀察了助陽開郁方對抑郁癥大鼠海馬BDNF及其信號轉導重要通路cAMP-CREB-BDNF通路的影響，結果發(fā)現(xiàn)CUMS大鼠海馬BDNF、CREB表達及cAMP含量顯著降低，中、高劑量助陽開郁方干預可顯著上調(diào)大鼠海馬組織BDNF、CREB mRNA表達水平，同時增高大鼠海馬組織cAMP含量，表明助陽開郁方調(diào)節(jié)海馬組織BDNF的表達及其cAMP-CREB-BDNF通路中信號分子的異常表達，這可能是改善抑郁大鼠的抑郁行為的重要機制之一。

抑郁癥的發(fā)生與社會、心理、遺傳等因素密切相關，病理生理變化多樣而復雜，發(fā)病機制涉及神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)等功能失調(diào)，但由于抑郁癥發(fā)病機制尚不完全明確，而中藥復方往往可從多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點調(diào)節(jié)，因此對于抗抑郁中藥方劑的作用機制還有待進一步深入探索。