實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢測中的應(yīng)用概況

蘇 杉，王 蓉，趙 敏，高慧琴

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕Y狀的慢性、全身性自身免疫病。其不僅侵犯關(guān)節(jié)滑膜、軟骨、韌帶和肌肉，還可能影響心、肺等臟器功能［1］，主要臨床癥狀表現(xiàn)為局部關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、晨僵、關(guān)節(jié)軟骨破壞、貧血等［2］。RA的病因尚未明確，缺乏根本的藥物治療，目前治療該病的理想效果是抑制炎癥發(fā)展，預(yù)防骨質(zhì)侵蝕或關(guān)節(jié)破壞，最大程度地改善患者的生活質(zhì)量。研究證明，RA患者的關(guān)節(jié)滑膜在發(fā)病3個(gè)月之內(nèi)可能出現(xiàn)破壞，一旦出現(xiàn)破壞便很難逆轉(zhuǎn)，所以早期診斷及治療對于控制病情的發(fā)展、降低致殘率尤為重要［3］。臨床目前主要靠癥狀表現(xiàn)、影像和血清類風(fēng)濕因子（RF）水平診斷RA。而早期的癥狀表現(xiàn)常不典型，關(guān)節(jié)軟骨有一定程度的破壞時(shí)影像才能發(fā)現(xiàn)，且RF在RA早期可能不出現(xiàn)，因此缺乏特異性［4］。因此，提高RA的早期診斷能力是目前面臨的重要難題。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)可定性檢測病原體，有較高的靈敏度，但卻無法實(shí)現(xiàn)病原體的定量檢測。而高靈敏性和特異性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)譜的準(zhǔn)確定量，可以用于解釋炎癥反應(yīng)、自身免疫疾病中的免疫致病途徑，即便待測樣本中細(xì)胞因子含量極低［5］。因此，該技術(shù)在疾病診斷與療效監(jiān)控中的應(yīng)用在逐步推廣。現(xiàn)就實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在RA檢測中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 血液檢測

有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在冠狀動脈、自身免疫疾病等患者的血液中表達(dá)失調(diào)，對RA的診斷有一定價(jià)值［6-7］。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a及miR-155在RA患者體中異常表達(dá)，與該病發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系［8］。馮佳等［9］采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測了miR-146a及miR-155在RA患者外周血的表達(dá)水平，并結(jié)合關(guān)節(jié)疾病活動度評分（DAS28）、血沉（ESR）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、免疫球蛋白 M（IgM）、類風(fēng)濕因子（RF）等指標(biāo)，分析miR-146a及miR-155在RA檢測中的意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者的miR-146a、miR-155表達(dá)上調(diào)，且與ESR、CRP、DAS28呈正相關(guān)，而與IgM、RF無相關(guān)性。認(rèn)為miR-146a和miR-155在RA患者外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)水平與RA病情活動性相關(guān)，可作為判斷該病活動程度的有效指標(biāo)。

核因子κB（NF-κB）的異常表達(dá)是RA的主要特點(diǎn)之一，NF-κB信號通路在RA炎癥進(jìn)程中發(fā)揮重要作用［10］。鋅指蛋白A20對NF-κB信號通路和TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路起負(fù)調(diào)控作用［11］。朱麗花等［12］采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)檢測了RA患者外周血和關(guān)節(jié)液中A20和NF-κB基因的表達(dá)水平以及經(jīng)治療后該基因表達(dá)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者外周血A20的表達(dá)顯著減少，而NF-κB的表達(dá)水平上調(diào)，經(jīng)治療后疾病緩解，A20的表達(dá)有所恢復(fù)。關(guān)節(jié)液中A20和NF-κB與外周血中的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

激活過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ）可以調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，并有抗炎作用［13］。研究顯示，PPAR-γ激動劑吡格列酮具有較好的抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎作用［14］。陳瑞林等［15］采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對PPAR-γ在RA患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中 PPAR-γ mRNA的表達(dá)與關(guān)節(jié)疾病活動度評分（DAS28）呈負(fù)相關(guān)，患者疾病活動度越低，PPAR-γ的表達(dá)水平越高，認(rèn)為PPAR-γ的表達(dá)水平可作為判斷RA疾病活動度的有效指標(biāo)。

Xu GX 等［16］研究發(fā)現(xiàn) miR-142-3p 通過靶向調(diào)控靶基因白介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK-1）的表達(dá)，從而影響下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如NF-κB、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。趙涌等［17］采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測了微小RNA（miR）-142-3P在RA患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平，并分析其與ESR、CRP、RF臨床指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-142-3p在RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)增加，且和疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，認(rèn)為miR-142-3p可能參與了RA的發(fā)病。

研究表明，炎癥因子白介素-17（IL-17）可誘導(dǎo)RA的滑膜細(xì)胞分泌IL-6、IL-8及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，加重關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)及軟骨破壞［18］。林錦驃等［19］采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-17 mRNA的表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附法測定血清抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP），免疫比濁法檢測RF含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者血清中RF、抗CCP含量和IL-17 mRNA的表達(dá)均顯著高于正常對照組，且呈正相關(guān)。提示抗CCP和RF含量及IL-17 mRNA表達(dá)的聯(lián)合動態(tài)監(jiān)測有助于RA的診斷和治療。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）是具有降解細(xì)胞外基質(zhì)能力的蛋白溶解酶家族，在該家族中MMP-3被認(rèn)為是產(chǎn)生軟骨降解作用最主要的蛋白酶［20］。周磊等［21］采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-3 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)RA患者M(jìn)MP-3 mRNA的表達(dá)水平高于健康人群，活動期RA患者該基因的表達(dá)水平高于非活動期患者。提示MMP-3 mRNA的表達(dá)水平與RA的發(fā)病及疾病活動相關(guān)。

2 滑膜檢測

RA是以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥、軟骨吸收及骨質(zhì)纖維化為主要特征的慢性炎癥疾病?；な荝A的靶器官，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞隨著病情的惡化惡性增生，血管翳形成，并逐漸破壞關(guān)節(jié)軟骨，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形及功能障礙。在RA發(fā)病的初期，以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要特征，一般尚未發(fā)生骨質(zhì)破壞，若在發(fā)病初期診斷并及時(shí)治療預(yù)后良好［22］。目前研究發(fā)現(xiàn)白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、白介素-17（IL-17）及TNF-α等細(xì)胞因子與誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥有關(guān)。

脂肪組織可分泌大量脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素等，參與炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)［23］。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是參與調(diào)控RA血管翳產(chǎn)生的關(guān)鍵因子之一［24］。王磊等［25］給予膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射脂聯(lián)素，并觀察其對小鼠發(fā)病的影響，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HIF-1α、IL-17、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示關(guān)節(jié)局部組織中HIF-1α、IL-17、IL-6的表達(dá)增加，TNF-α未見差異。同時(shí)又用不同濃度的AD刺激RA小鼠的滑膜成纖維細(xì)胞72 h，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白印跡技術(shù)（western blot，WB）檢測HIF-1α、IL-17、IL-6和 TNF-α的表達(dá)水平，結(jié)果顯示AD呈劑量依賴性地促進(jìn)HIF-1α、IL-17、IL-6的表達(dá)水平，而TNF-α未見差異。

轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶（TAK1）是發(fā)生炎癥反應(yīng)細(xì)胞信號傳導(dǎo)上游重要的激酶，可能對關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)病有著重要調(diào)節(jié)作用［26］。MMPs家族是RA患者軟骨破壞的主要家族，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）是MMPs家族的抑制劑，其中TIMP1可抑制多數(shù)MMP。蘭忠煜等［27］收集了11例RA患者的滑膜組織，并對滑膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，后采用轉(zhuǎn)染的方法將TAK1特異的小干擾RNA導(dǎo)入RA患者的滑膜細(xì)胞中，探究TAK1對滑膜細(xì)胞中MMP9及TIMP1表達(dá)水平的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制TAKl在RA滑膜細(xì)胞中的表達(dá)，MMP9 mRNA的降低率為 74.76%，TIMP1 mRNA的沉默率為31.51%，雖同時(shí)降低，但兩者之間的平衡被打破。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染技術(shù)可以抑制TAK1在RA滑膜細(xì)胞中的表達(dá)水平；MMP9 mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)，對于抑制患者的軟骨破壞有重要意義；靶向抑制TAK1打破了MMP9 mRNA與TIMP1 mRNA之間的平衡，降低了RA患者軟骨的破壞。

VEGF是血小板源生長因子（PDGF）家族的成員之一，具有促使血管翳的生成和提高血管通透性作用，在RA的早期就可出現(xiàn)。單味中藥雷公藤的療效肯定，雷公藤多苷片是雷公藤經(jīng)提純得到，它對RA、腫瘤等血管新生疾病有明顯療效。韓曼麗［28］采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了模型對照組、空白組、雷公藤多苷片組及沙利度胺陽性藥對照組大鼠肺、心、肝、腎與滑膜組織中VEGF mRNA的表達(dá)水平，并進(jìn)行了關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷片組、沙利度胺陽性藥對照組大鼠的關(guān)節(jié)炎評分及關(guān)節(jié)腫脹度比模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；雷公藤多苷片組大鼠不同臟器中VEGF mRNA的表達(dá)水平降低，且與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與沙利度胺陽性藥對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。認(rèn)為雷公藤多苷片治療Ⅱ型膠原關(guān)節(jié)炎大鼠的作用機(jī)制可能與降低VEGF的表達(dá)水平有關(guān)。

3 關(guān)節(jié)液檢測

研究證實(shí)，一些抗體含量在滑液中比在血清中更高［29］。在RA的診斷過程中，抽取患者關(guān)節(jié)液進(jìn)行相關(guān)的抗體檢測，對RA早期診斷及早期有效治療有重要意義。

淋巴毒素 β 受體 （lymphotoxin β receptor，LTβR）是TNF-α受體家族的一個(gè)成員。研究發(fā)現(xiàn)，LTβR信號通路參與了T細(xì)胞活化，可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡等，在RA等自身免疫性疾病的病程中起積極作用。小鼠的LTβR免疫球蛋白可以抑制關(guān)節(jié)炎敏感性，為RA的治療提供新的思路［30］。鄒安慶等［31］研究發(fā)現(xiàn)LTβB信號通路中的LTβR、磷酸化轉(zhuǎn)錄因子（ReLB）mRNA在RA患者的關(guān)節(jié)腔積液中表達(dá)水平高，認(rèn)為其對于RA的診斷具有重要意義。

巨嗜細(xì)胞炎癥蛋白-1α（MIP-1α）是主要由單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨嗜細(xì)胞產(chǎn)生的一種促進(jìn)淋巴細(xì)胞向炎癥部位遷移并活化的因子［32］。郭大文等［33］采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測了8位活動期RA患者滑液單個(gè)核細(xì)胞（SFMC）及血清單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中MIP-1 mRNA的表達(dá)水平，并檢測了血清中CRP及滑液白細(xì)胞數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者SFMC MIP-1α mRNA的表達(dá)水平較PBMC中的表達(dá)水平高，且與CRP、滑液白細(xì)胞數(shù)有正相關(guān)性。

4 其他組織檢測

胡秋俠等［34］采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了RA患者的尿沉渣中miR-146a的表達(dá)水平，并分析了其與RA臨床相關(guān)指標(biāo)的聯(lián)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146a在RA患者的表達(dá)水平高于健康人群，活動期患者的表達(dá)水平高于非活動期患者，非活動期患者的表達(dá)水平高于健康人群，且尿沉渣中miR-146a的表達(dá)水平與DAS28評分、ESR、CRP呈正相關(guān)。認(rèn)為miR-146a可能參與了RA疾病的發(fā)生。

人參皂苷是人參中的主要有效成分。有研究證實(shí)，人參皂苷Rg1具有糖皮質(zhì)激素樣作用及抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［35］。對于膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)具有緩解作用［36］。藺娜等［37］用TNF-α刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），再加入不同濃度的人參皂苷Rg1，培養(yǎng)24 h后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及western Blot檢測MMP-9及VEGF的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可以抑制由TNF-α刺激HUVECs的MMP-9和VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)，認(rèn)為人參皂苷Rg1可能具有治療RA的功用。

RA引起的骨質(zhì)侵蝕或關(guān)節(jié)畸形，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，一旦發(fā)生這種關(guān)節(jié)畸形便很難治愈。所以早期發(fā)現(xiàn)、有效治療至關(guān)重要。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已逐漸成為科研的主要工具，對RA患者或風(fēng)濕模型的血液、關(guān)節(jié)滑膜、關(guān)節(jié)液及其他各組織中的研究逐漸深入，為解釋RA的發(fā)病機(jī)制及治療機(jī)制提供可能，有助于醫(yī)生對疾病的診斷與治療的實(shí)時(shí)監(jiān)控。雖然該技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)相比有著明顯的優(yōu)勢，但卻也有不足：設(shè)備要求高，檢測費(fèi)用昂貴，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)準(zhǔn)品及完善的質(zhì)量評價(jià)體系。但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的研究逐步深入，設(shè)備與檢測費(fèi)用的降低及技術(shù)的普及，該技術(shù)運(yùn)用于RA等疾病的早期臨床診斷及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究將更加廣泛。