不同劑量消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑對人前列腺癌移植瘤裸鼠的影響

王志剛，汪 珊

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405）

前列腺癌作為泌尿外科常見的惡性腫瘤疾病，近年來在我國的發(fā)病率逐年上升，且大多數(shù)患者確診前列腺癌時往往已錯過手術(shù)治療的最佳時機。根據(jù)腫瘤分期，往往采用以藥物去勢作為主要手段的內(nèi)分泌治療方法。但隨著治療的不斷深入，很多患者發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）。目前CRPC治療在國內(nèi)外均沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和方案，而中醫(yī)藥的優(yōu)勢日漸凸顯。

PC3細(xì)胞是從人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移腫瘤中分離出來的，被廣泛用于雄激素抵抗型的前列腺癌的研究。目前我們對晚期前列腺癌和雄激素非依賴階段的前列腺癌相關(guān)的發(fā)病機制知之甚少，尚無有效的治療方法，相關(guān)研究仍然處于摸索階段［1］，PC3細(xì)胞也是目前常用的前列腺癌細(xì)胞之一。

消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑是我院的經(jīng)驗方，在前列腺癌的臨床治療中應(yīng)用廣泛。本研究以人前列腺癌裸鼠移植瘤模型為對象，通過對裸鼠皮下注射體外培養(yǎng)的人前列腺癌PC3細(xì)胞懸液進(jìn)行接種造模，成功建立人前列腺癌移植瘤模型，從裸鼠體質(zhì)量、攝食量變化、腫瘤體積、抑瘤率等方面系統(tǒng)觀察不同劑量下消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑對人前列腺癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 PF級BALB/C（nu/nu）裸鼠59只（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)藥SPF級動物實驗室），4 w 齡，16～20 g，雄性。合格證號：粵監(jiān)證字2008C067號。

1.1.2 儀器與試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液（雙抗）、二甲基亞砜（DMSO）（美國Gibco公司）；PBS磷酸鹽緩沖液、臺盼藍(lán)溶液（Hyclone）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青公司）；Trizol Reagent（Invitrogen Life Technologies）；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；β-actin單克隆抗體（Abcam公司批號Ab8227）；PTEN鼠單克隆抗體（Abcam公司 批號 Ab79156）；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（CST公司批號 #7076）；RIPA裂解液、蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（博士德）；PMSF、Tris、甘氨酸、SDS（Sigma）；-80℃低溫冰箱（SANYO）；超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電熱恒溫水溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；一次性細(xì)胞塑料培養(yǎng)瓶、一次性移液管、凍存管、離心管（Corning）等。

1.1.3 實驗藥物 消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑由山慈菇30 g，夏枯草 30 g，莪術(shù) 30 g，虎杖 30 g，吳茱萸 15 g組成（相當(dāng)于中劑量組0.87 g/mL），購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。將中藥用蒸餾水煎煮濃縮后制成高、中、低3個濃度水煎劑，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

將59只荷瘤裸鼠隨機分為對照組，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低、中、高劑量組4組。人前列腺癌PC-3細(xì)胞培養(yǎng)完成后保存細(xì)胞懸液，對裸鼠進(jìn)行細(xì)胞接種，在非麻醉狀態(tài)下，腹臥位固定裸鼠，用75%酒精棉球?qū)π∈笥叶髠?cè)及頸背部皮膚進(jìn)行消毒處理，后用鑷子提起裸鼠頸部皮膚，用注射器注入PC3細(xì)胞懸液0.2 mL，并用鑷子輕輕夾住針刺部位數(shù)秒鐘后再次對注射部位消毒即完成。前列腺癌裸鼠模型完成后，于細(xì)胞接種后第10天開始灌腸，灌腸前對各組裸鼠禁食6 h。消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑按照人和小鼠間等效劑量比率換算小鼠的等效劑量，按照低劑量組0.44 g/mL、中劑量組0.87 g/mL、高劑量組1.74 g/mL進(jìn)行給藥，對照組給予等劑量生理鹽水，灌腸劑量按照每只0.02 g/mL，隔天1次，共30 d。

1.3 觀察指標(biāo)

①觀察體外培養(yǎng)的人前列腺癌PC3細(xì)胞株增長狀態(tài)。②觀察各組裸鼠細(xì)胞接種后精神活動狀態(tài)，進(jìn)食進(jìn)水情況，接種部位變化，體質(zhì)量外形變化。③觀察消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑對裸鼠前列腺癌移植瘤的抑瘤作用，包括抑瘤率和腫瘤體積變化。

于治療當(dāng)日和治療開始后每5 d用游標(biāo)卡尺測量1次皮下移植瘤的長徑a和短徑b，觀察記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。30 d后，將小鼠脫頸處死，取腫瘤瘤體，計算腫瘤體積（V）和腫瘤生長抑制率（Y）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組樣本采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

圖1 裸鼠腫瘤外觀

細(xì)胞接種后，裸鼠右側(cè)頸背部見大約0.5 cm×0.5 cm的皮丘，無破潰，無滲出。小鼠在實驗初期在精神和形態(tài)方面均與正常小鼠無異且攝食正常，約5～7 d于原腫瘤細(xì)胞接種部位出現(xiàn)肉眼可見粒狀突起物，隨后腫物快速增長，約10 d左右小鼠腫瘤體積均可達(dá)10 mm3以上，成瘤率100%（圖1）。隨著腫瘤體積變大，小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，攝食進(jìn)水量減少，行動緩慢。4 w時，上述表現(xiàn)越發(fā)明顯，少數(shù)裸鼠體質(zhì)量開始減輕，呈惡病質(zhì)表現(xiàn)。

2.2 消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑對裸鼠前列腺癌移植瘤的抑瘤作用

2.2.1 裸鼠30 d攝食和體質(zhì)量變化 用藥前消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑各劑量組與對照組體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。給藥完成后，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑各劑量組與對照組裸鼠體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表 1。

表1 兩組裸鼠灌腸前后體質(zhì)量變化 （±s）

表1 兩組裸鼠灌腸前后體質(zhì)量變化 （±s）

注：與對照組比較，P＜0.05，P＜0.01

組別 n 灌腸前(g) 灌腸后(g)對照組 15 19.49±1.16 17.67±.37消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低劑量組 14 20.09±1.33 18.83±1.381）消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑中劑量組 15 20.31±1.24 23.58±2.372）消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑高劑量組 15 19.98±1.22 24.69±2.642）1）2）

2.2.2 荷瘤裸鼠腫瘤體積的變化 給藥前4組小鼠腫瘤體積大小比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），治療結(jié)束后，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑中劑量組、高劑量組與對照組腫瘤體積比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低劑量組腫瘤體積與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低、中、高劑量組對腫瘤體積的抑制率呈現(xiàn)上升趨勢，可見不同劑量灌腸對荷瘤小鼠腫瘤抑制作用有一定的量效關(guān)系。結(jié)果見表2。

表2 不同劑量裸鼠腫瘤體積、抑瘤率比較 （±s）

表2 不同劑量裸鼠腫瘤體積、抑瘤率比較 （±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05

組別 腫瘤體積（cm3） 抑制率（%）治療前 治療后對照組 0.11±0.05 1.29±0.27 -消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低劑量組 0.12±0.06 1.21±0.37 6.20消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑中劑量組 0.09±0.04 1.01±0.411） 21.71消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑高劑量組 0.10±0.05 0.99±0.381） 23.26

2.2.3 荷瘤小鼠30 d攝食量變化 各組荷瘤小鼠攝食量在接種4 w后，對照組裸鼠平均體質(zhì)量逐漸下降，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑各劑量組裸鼠平均體質(zhì)量總體仍呈增長趨勢，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑低、中、高劑量組平均攝食量高于對照組，可見灌腸給藥在一定程度上提高了小鼠的生存質(zhì)量。結(jié)果見表3。

表3 不同劑量組荷瘤小鼠進(jìn)食量變化 （g）

3 討論

消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑作為中藥復(fù)方制劑，在我院臨床已經(jīng)廣泛使用，是嚴(yán)格遵守中醫(yī)辨證理論，同時建立在臨床研究和藥理實驗基礎(chǔ)上，經(jīng)過長時間臨床觀察驗證的一組自擬經(jīng)驗方，由山慈菇、夏枯草、莪術(shù)、虎杖、吳茱萸5味藥物組成，是我院前列腺癌治療中常用的經(jīng)典方。諸藥合用清熱散結(jié)，其組成符合前列腺癌氣血凝滯、痰濁結(jié)聚、邪毒壅積的病理基礎(chǔ)。君藥山慈菇清熱解毒、消癰散結(jié)，山慈菇多糖具有一定的抗腫瘤作用，其作用機制可能與免疫調(diào)節(jié)及相關(guān)蛋白表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)［2］。臣藥夏枯草清火明目、散結(jié)消腫，其主要活性化學(xué)成分是三萜類、黃酮類、甾體類、香豆素類等，具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等藥理作用。莪術(shù)、虎杖行氣破血，消積止痛，莪術(shù)的藥用發(fā)現(xiàn)始載于《唐本草》，研究表明莪術(shù)油中主要的抗腫瘤活性單體成分是β-欖香烯，不僅對非瘤性的白血病細(xì)胞具有抑制其增殖，誘導(dǎo)其凋亡的作用，也可以使眾多的實體瘤細(xì)胞的凋亡率明顯提高，增殖率明顯下降［3］。呋喃二烯對10種人腫瘤細(xì)胞的體外增殖有抑制作用［4］，且抑制率隨藥物劑量的增加而增加，有顯著的劑量依賴性和較強的細(xì)胞毒性。虎杖中含有的白藜蘆醇的多種藥理作用中最引人注目的是抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用表現(xiàn)為對腫瘤的起始、促進(jìn)和發(fā)展3個階段均有抑制作用。白藜蘆醇可通過多種機制對多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的拮抗作用［5］。吳茱萸溫中開郁行氣，吳茱萸堿可對多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，具有抗腫瘤活性，如前列腺癌PC3細(xì)胞，相關(guān)機制可能與吳茱萸堿抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻斷細(xì)胞周期，通過Caspase 依賴途徑誘導(dǎo)凋亡有關(guān)［6］。

消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑在臨床中療效得到了認(rèn)可。有臨床觀察發(fā)現(xiàn)在最大限度雄激素阻斷治療（MAB）同時予以消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑灌腸2個月后，比單純MAB治療可明顯降低前列腺癌患者血清PSA，改善尿流率，一定程度上抑制或延緩腫瘤的轉(zhuǎn)移［7］。中藥復(fù)方配比、制作過程及流程相對簡單，故用中藥灌腸治療疾病較為普遍，中藥制劑和化療藥物聯(lián)合灌腸在提高免疫功能以及對直腸癌局部癥狀的緩解上具有協(xié)同性，通過適當(dāng)直腸給藥，可避免肝臟首過效應(yīng)，直腸吸收比口服吸收慢，可以延長藥物作用時間，可起到局部和/或全身作用［8］。本實驗用低、中、高劑量的消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑對腫瘤細(xì)胞株P(guān)C3接種成功的BALB/C（nu/nu）裸鼠進(jìn)行灌腸后，中、高劑量組裸鼠腫瘤體積與對照組比較明顯減?。≒＜0.05），低劑量組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；低、中、高劑量組抑瘤率分別為6.20%、21.71%、23.26%，可見消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑可以抑制人前列腺癌裸鼠移植瘤的增長，抑瘤率與藥物濃度成正比，高、中劑量組的抑瘤率比較接近，兩組荷瘤裸鼠攝食量也有所增加；給藥后低、中、高劑量組體質(zhì)量與對照組比較均出現(xiàn)緩慢增長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），說明荷瘤小鼠的生存質(zhì)量得到改善。綜上分析，消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑可以提高荷瘤裸鼠的生存質(zhì)量，抑瘤率與藥物濃度成正相關(guān)。荷瘤裸鼠體質(zhì)量和攝食量變化同樣受到藥物劑量影響。

消瘀散結(jié)抑癌灌腸劑是我院臨床使用較為成熟的經(jīng)驗方之一，本次研究的體外移植瘤裸鼠模型并不能全面反映藥物在人體內(nèi)的抑瘤作用，實驗對4個分組裸鼠的體質(zhì)量變化、攝食改變、抑瘤率和腫瘤體積進(jìn)行了比較研究，具有一定局限性。

實驗中我們用輸尿管導(dǎo)管制作的灌腸器操作簡便安全，并能根據(jù)裸鼠大小調(diào)整型號，有效防止了實驗動物的意外受傷和死亡，盡可能保證了實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。低、中、高3個劑量組設(shè)計參考了臨床用藥劑量，豐富了不同劑量的實驗數(shù)據(jù)，為臨床用藥提供了一定參考，其對前列腺癌的抑制作用機制將在下一步研究中繼續(xù)完善。