闌尾黏液性腫瘤患者腫瘤抑制蛋白質(zhì)p53、Ki-67抗原表達(dá)及相關(guān)生物學(xué)行為評價(jià)

鄭鶴 曹亮 范學(xué)亮 王中山

（河南省鄭州金域臨床檢驗(yàn)中心病理科 鄭州450000）

闌尾黏液性腫瘤屬闌尾原發(fā)性腫瘤主要病理類型之一，以良性病變?yōu)橹鳎缙谌狈μ禺愋耘R床癥狀及體征，多于合并感染時(shí)出現(xiàn)類似慢、急性闌尾炎的臨床癥狀及體征[1]。闌尾黏液性腫瘤在臨床較為少見，約占全部闌尾疾病的0.3%，但若未及時(shí)治療易誘發(fā)腹膜假黏液瘤（Pseudomyxoma Peritonei，PMP），有惡變趨勢[2]。目前臨床對該疾病的實(shí)驗(yàn)研究較少，缺乏對其分子病理基礎(chǔ)及生物學(xué)行為等方面的認(rèn)識。基于此，本研究選取我中心病理科確診的48例闌尾黏液性腫瘤的手術(shù)標(biāo)本蠟塊為觀察組，旨在分析腫瘤抑制蛋白質(zhì)p53、增殖細(xì)胞核抗原Ki-67表達(dá)與闌尾黏液性腫瘤病理特征及腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我中心病理科2015年1月～2018年7月經(jīng)病理學(xué)確診的48例闌尾黏液性腫瘤的手術(shù)標(biāo)本為觀察組，另取同期41例因單純性闌尾炎行闌尾切除的闌尾組織標(biāo)本為對照組。觀察組男21例，女27例；年齡44～69歲，平均年齡（56.41±6.71）歲；體質(zhì)量指數(shù) 18.3～24.5 kg/m2，平均體質(zhì)量指數(shù)（21.30±1.44）kg/m2；黏液腺癌 22例，低級別黏液性腫瘤26例。對照組男18例，女23例；年齡 42～68歲，平均年齡（56.08±6.80）歲；體質(zhì)量指數(shù)18.2～24.6 kg/m2，平均體質(zhì)量指數(shù)（21.25±1.51）kg/m2。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，具有可比性。本研究已經(jīng)通過醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書，并排除繼發(fā)性闌尾腫瘤、出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及臨床資料不全者。

1.2 檢驗(yàn)方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)二步法分別檢測p53蛋白、Ki-67抗原在闌尾黏液性腫瘤和單純性闌尾炎中的表達(dá)水平。

1.2.1 主要試劑 北京安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司生產(chǎn)的鼠抗人p53蛋白單抗、鼠抗人Ki-67單抗；上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)的EDTA抗原修復(fù)液、免疫組織化學(xué)二步試劑、濃縮型DBA試劑盒。

1.2.2 具體操作 所有標(biāo)本均以4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4～5 μm連續(xù)切片，常規(guī)作HE染色，同時(shí)采用工作液對p53蛋白、Ki-67抗原進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。以EDTA抗原修復(fù)液高壓修復(fù)抗原2.5 min。選取已知陽性片作為陽性對照，并以PBS代替一抗作為陰性對照。由兩位高年資病理科醫(yī)師于光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組織化學(xué)切片，計(jì)數(shù)分析且采用數(shù)碼照相系統(tǒng)拍照。

1.2.3 結(jié)果判定 （1）p53染色：細(xì)胞核內(nèi)呈均一棕色或棕黃色顆粒為免疫組化陽性。光鏡下觀察5個(gè)有代表性的高倍視野，按切片陽性細(xì)胞占比分成4個(gè)等級：陽性細(xì)胞＜10%記（－），陽性細(xì)胞10%～25%記（+），陽性細(xì)胞 26%～50%記（++），陽性細(xì)胞＞50%記（+++）。（2）Ki-67抗原染色定位于細(xì)胞核。按Ki-67抗原標(biāo)記指數(shù)（LI）將陽性結(jié)果分成4個(gè)等級：0%～10%記Ⅰ級，11%～25%記Ⅱ級，26%～50%記Ⅲ級，＞50%記Ⅳ級。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。Ki-67抗原陽性率=（Ⅲ級+Ⅳ級）/計(jì)數(shù)細(xì)胞×100%。

1.3 觀察指標(biāo) （1）觀察兩組p53蛋白、Ki-67抗原表達(dá)情況。（2）分析p53蛋白、Ki-67抗原表達(dá)與闌尾黏液性腫瘤患者性別、年齡、病理類型、是否形成PMP以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組p53蛋白、Ki-67抗原表達(dá)情況比較 觀察組中p53蛋白陽性表達(dá)15例，陽性表達(dá)率為31.25%（15/48）；Ki-67抗原標(biāo)記陽性22例，標(biāo)記陽性率為45.83%（22/48）。對照組p53蛋白陽性表達(dá)0例，陽性表達(dá)率為0.00%（0/41）；Ki-67抗原標(biāo)記陽性4例，標(biāo)記陽性率為9.76%（4/41）。觀察組p53蛋白陽性表達(dá)率及Ki-67抗原標(biāo)記陽性率明顯高于對照組（P＜0.05）。

2.2 p53蛋白、Ki-67抗原表達(dá)與闌尾黏液性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系 不同病理類型、有無淋巴轉(zhuǎn)移、有無出現(xiàn)PMP的闌尾黏液性腫瘤患者p53蛋白陽性率比較，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡及不同性別的闌尾黏液性腫瘤患者p53蛋白陽性率比較，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同病理類型、有無淋巴轉(zhuǎn)移的闌尾黏液性腫瘤患者Ki-67抗原陽性率比較，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、不同性別、有無出現(xiàn)PMP的闌尾黏液性腫瘤患者Ki-67抗原陽性率比較，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 p53蛋白、Ki-67抗原表達(dá)與闌尾黏液性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系[例（%）]

3 討論

闌尾黏液性腫瘤臨床相對少見，其與PMP的發(fā)生存在密切關(guān)系，相關(guān)研究已證實(shí)，闌尾黏液性腫瘤為引起PMP的關(guān)鍵因素之一[3～4]。但目前闌尾黏液性腫瘤及PMP尚缺乏特異性臨床特征，基于此，本研究嘗試自分子病理學(xué)角度分析，以期為闌尾黏液性腫瘤臨床診斷及評估預(yù)后提供數(shù)據(jù)參考。

p53為目前發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤關(guān)系最為密切的腫瘤基因，其參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化/凋亡、DNA修復(fù)等生物學(xué)過程。野生型p53（wtp53）為腫瘤抑制基因，而突變型p53（mtp53）基因表達(dá)產(chǎn)物已喪失抑制腫瘤異常增殖作用，具有癌基因效果。mtp53蛋白半衰期延長明顯，可通過免疫組化法檢出，mtp53蛋白過表達(dá)則提示p53基因已發(fā)生突變[5]。王賁士等[6]學(xué)者研究指出，mtp53基因過表達(dá)與腫瘤惡性程度關(guān)系密切。Ki-67是人類增殖細(xì)胞核抗原，其表達(dá)異常可評估細(xì)胞的增生活性。據(jù)報(bào)道[7～8]，Ki-67抗原與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，觀察組p53蛋白陽性表達(dá)率及Ki-67抗原標(biāo)記陽性率明顯高于對照組（P＜0.05）。說明闌尾黏液性腫瘤患者p53蛋白、Ki-67抗原陽性率會出現(xiàn)顯著升高，可作為臨床診斷該疾病的指標(biāo)。p53突變基因可促進(jìn)腫瘤惡性轉(zhuǎn)化，而Ki-67抗原異常表達(dá)能提高腫瘤細(xì)胞增殖活性，二者具有協(xié)同效果，共同參與腫瘤的生物學(xué)過程。本研究結(jié)果還顯示，不同病理類型、有無淋巴轉(zhuǎn)移、有無出現(xiàn)PMP的闌尾黏液性腫瘤患者p53蛋白陽性率比較，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同病理類型、有無淋巴轉(zhuǎn)移的闌尾黏液性腫瘤患者Ki-67抗原陽性率比較，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明p53蛋白、Ki-67抗原表達(dá)水平與闌尾黏液性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。綜上所述，闌尾黏液性腫瘤中p53蛋白、Ki-67抗原陽性率均顯著升高，聯(lián)合檢測p53蛋白、Ki-67抗原對評估闌尾黏液性腫瘤的生物學(xué)行為具有積極作用，可為臨床治療提供數(shù)據(jù)支持。