脊髓5-HT受體參與電針內(nèi)關(guān)穴對大鼠心臟傷害性感受的調(diào)控*

韓 曼 , 劉曉華 , 杜劍青

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)生理學(xué)教研室, 咸陽 712046； 2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)系, 陜西 西安 710061)

心絞痛是冠狀動脈供血不足、心肌急劇暫時缺血缺氧所引起的以發(fā)作性胸痛或胸部不適為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，是反映心肌已受到損傷并危及生命的重要警示信號。許多病人在經(jīng)歷過心絞痛后會引發(fā)胸痛后遺癥，如續(xù)發(fā)的纖維肌痛，并伴有肌肉緊張性的增加，給患者帶來極大的身體痛苦[1]。臨床和實驗研究已經(jīng)證明電針內(nèi)關(guān)穴能夠改善心肌缺血及再灌注發(fā)生后的心功能，但這些實驗研究大都關(guān)注針刺對局部心肌組織改善、心血管活性物質(zhì)、心肌能量代謝與離子通道影響等方面[2-5]，針刺對心絞痛的鎮(zhèn)痛效果及其中樞調(diào)控機制的實驗研究甚少。動物雖無心絞痛的主觀體驗，可是存在與其類似的心臟傷害性感受反應(yīng)。2001年，Jou及他的同事通過心包內(nèi)注射致痛物質(zhì)建立了與冠狀動脈結(jié)扎相似的心臟傷害性感受動物模型，該模型以背斜方肌肌電(electromyogram, EMG)為痛反應(yīng)的觀測指標(biāo)[6]。本實驗室在此模型基礎(chǔ)之上，對心臟傷害性感受的中樞調(diào)控機制研究已取得初步進展[7,8]。

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)參與痛覺信息調(diào)控的主要神經(jīng)遞質(zhì)[9,10]，針刺效應(yīng)與中樞5-HT有著密切的聯(lián)系，研究表明針刺可以促進中縫大核等中樞核團內(nèi)5-HT的合成、并加速其釋放和利用，但也可減弱5-HT的活動[11]。神經(jīng)科學(xué)研究表明中縫大核內(nèi)5-HT能神經(jīng)元發(fā)出下行纖維投射至脊髓背角。那么，電針(electroacupuncture，EA)內(nèi)關(guān)穴對心臟傷害性感受是否具有調(diào)控作用？脊髓水平的5-HT受體是否參與其中？麥角新堿作為5-HT1和5-HT2受體的拮抗劑被廣泛使用。因此，本研究通過電針內(nèi)關(guān)穴聯(lián)合鞘內(nèi)注射麥角新堿及其溶媒，觀察大鼠心包內(nèi)注射緩激肽(bradykinin，BK)誘發(fā)背斜方肌EMG的變化，探討電針內(nèi)關(guān)穴對大鼠心臟傷害性感受的鎮(zhèn)痛作用及脊髓水平5-HT及其受體在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與實驗藥品

BL-420A生物信號采集與分析系統(tǒng)(成都泰盟生物科技有限公司)；蠕動泵(BT100-2J，保定蘭格恒流泵有限責(zé)任公司)；小動物呼吸機(DW3000-B型，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；韓式穴位神經(jīng)刺激儀(LH202H，北京華運安特科技有限責(zé)任公司)。

戊巴比妥鈉、BK、麥角新堿均購于美國Sigma公司。麥角新堿溶于30%二甲基亞砜中，配置成5 μg/l；其余藥物均溶解于生理鹽水中，配制成所需濃度(戊巴比妥鈉：20 mg/ml及5 mg/ml；BK：0.001 mg/ml)。

1.2 實驗動物分組

實驗選用40只雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～300 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，大鼠在標(biāo)準(zhǔn)清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)。動物隨機分為5組：BK組、BK+EA組、BK+Methysergide組、BK+EA+ Methysergide組、BK+EA+Vehicle組，每組均為8只。各組大鼠均行心包內(nèi)插管，BK組心包內(nèi)間隔40 min注射0.2 ml緩激肽共3次；BK+EA組心包內(nèi)注射0.2 ml BK聯(lián)合電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴；BK+Methysergide組心包內(nèi)注射0.2 ml BK聯(lián)合鞘內(nèi)注射10 μl Methysergide；BK+EA+Methysergide組心包內(nèi)注射0.2 ml BK聯(lián)合電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴結(jié)合鞘內(nèi)注射10 μl Methysergide；BK+EA+Vehicle組心包內(nèi)注射0.2 ml BK聯(lián)合電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴結(jié)合鞘內(nèi)注射10 μl Vehicle。

1.3 實驗動物模型建立

實驗動物給予初始劑量為2%戊巴比妥鈉(45～55 mg/kg)腹腔麻醉。氣管插管對動物實施人工呼吸(呼吸頻率：60～70/min，潮氣量：5.0～6.0 ml)，左側(cè)頸靜脈插管后連接蠕動泵，0.05%戊巴比妥鈉(15 mg/kg·h)維持麻醉，右側(cè)頸總動脈插管，監(jiān)測平均動脈壓處于90～100 mmHg，從而保證一個穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)。暴露左側(cè)背斜方肌，記錄EMG。通過溫控儀維持大鼠體溫在(37.0±0.5)℃。

背斜方肌EMG的記錄：同芯電極插入背斜方肌約1.5～1.7 mm，通過BL-420A生物信號采集與分析系統(tǒng)記錄其EMG活動，每次BK誘發(fā)EMG活動總放電單位數(shù)(total number of motor unit discharges, TMUD)通過BL-420A分析軟件直接統(tǒng)計得出。由于不同大鼠BK誘發(fā)的TMUD有所不同，為了消除個體之間的差異，每只大鼠首次心包內(nèi)注射BK所誘發(fā)的TMUD，作為基礎(chǔ)對照，即為100%；其后續(xù)EMG的TMUD均以首次TMUD為分母進行標(biāo)化，得出百分?jǐn)?shù)，即EMG的變化率。

心包插管術(shù)與給藥方法：將實驗動物左側(cè)第1到第3肋軟骨切斷，暴露胸腺。沿胸腺中線分離胸腺，暴露心包膜。用玻璃探針的尖端在心包膜上開一小孔，將一內(nèi)徑0.051 cm、外徑0.094 cm、長12～14 cm遠(yuǎn)端有數(shù)個小洞的硅膠管順胸腺中線經(jīng)此孔插入心包約2 cm，依次縫合各層胸壁組織，以固定心包插管。通過心包插管心包內(nèi)注射BK 0.2 ml，記錄EMG活動60 s后回抽，0.2 ml無菌生理鹽水反復(fù)沖洗心包5次，同一只大鼠，心包注射BK每次間隔40 min。

1.4 脊髓蛛網(wǎng)膜下腔置管術(shù)與藥物注射

按照Yaksh介紹的方法行脊髓蛛網(wǎng)膜下腔置管。動物取俯臥位，于兩耳尖剪開皮膚，縱向分離肌肉，暴露枕骨大孔。用精細(xì)眼科手術(shù)剪小心剪開硬脊膜，可見清亮透明的腦脊液迅速涌出。使大鼠的頭部向下傾斜，沿脊髓尾側(cè)的方向?qū)⒁欢纬錆M生理鹽水長約10 cm PE-10管緩慢從枕骨大孔開口處插入到T3～T5蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)，將改良過的20 μl微量注射器與PE-10管連接，藥物注射體積為10 μl，注射的時間約1 min。每次實驗結(jié)束后，經(jīng)PE-10管注入10 μl 2%膀胺天藍(lán)以標(biāo)記藥物的擴散范圍，統(tǒng)計注射位置在T3～T5的實驗數(shù)據(jù)。

1.5 電針內(nèi)關(guān)穴

電針選取雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴，定位標(biāo)準(zhǔn)參照《實驗針灸學(xué)》[12]，“內(nèi)關(guān)”穴位于前肢內(nèi)側(cè)，腕關(guān)節(jié)上約3 mm的尺橈骨縫隙間。分別于雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴行毫針直刺2～3 mm，連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，選擇等幅疏密波進行電針刺激，頻率2 Hz/100 Hz，電流強度為2 mA。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

各處理因素干預(yù)大鼠心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG的變化率以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用One-way ANOVA并LSD檢驗進行分析，兩組間比較采用配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 心包內(nèi)注射BK誘發(fā)的EMG反應(yīng)

心包內(nèi)注射0.2 ml生理鹽水背斜方肌無放電，心包內(nèi)注射0.2 ml BK背斜方肌放電為 2 320 個(標(biāo)化為100%)，間隔40 min心包內(nèi)3次注射BK誘發(fā)的背斜方肌EMG百分?jǐn)?shù)分別為100%、(99.3±0.7)%、(98.6±0.7)%，3次之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖1A、B)

Fig.1Intrapericardial BK-evoked EMG responses of the dorsal spinotrapezius muscle

BK： Bradykinin； EMG： Electromyogram

2.2 電針內(nèi)關(guān)穴后心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG反應(yīng)的變化

電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴30 min后，心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG的TMUD為(48.3±0.8)%，與單純心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG的TMUD(100%)相比顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2A、B)。

Fig.2Changes of EMG responses before and after electroacupuncture at Neiguan point

BK： Bradykinin; EA： Electroacupuncture

*P<0.05vsBK

2.3 鞘內(nèi)注射麥角新堿后心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG反應(yīng)的變化

2%膀胺天藍(lán)標(biāo)記的藥物擴散范圍表明，各組大鼠鞘內(nèi)注射位點均位于T3～T5。鞘內(nèi)注射麥角新堿10 min后，心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG的TMUD為(97.7±0.3)%，與單純心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG的TMUD(100%)相比有所減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖3A)。

2.4 鞘內(nèi)注射麥角新堿聯(lián)合電針內(nèi)關(guān)穴后心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG反應(yīng)的變化

鞘內(nèi)注射麥角新堿10 min后，再電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴30 min，心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG的TMUD為(81.2±0.8)%，與電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴30 min后，心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG的TMUD(48.0±0.7)%相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖3B)。

Fig.3Effect of electroacupuncture at Neiguan on EMG responses before and after intrathecal injection of methysergide or vehicle

BK： Bradykinin; EA： Electroacupuncture

*P<0.05vsBK;#P<0.05vsEA+BK

2.5 鞘內(nèi)注射溶媒聯(lián)合電針內(nèi)關(guān)穴后心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG反應(yīng)的變化

鞘內(nèi)注射溶媒10 min后，再電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴30 min，心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG的TMUD為(50.4±1.1)%，與電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴30 min后，心包內(nèi)注射BK誘發(fā)EMG的TMUD(48.1±1.0)%相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖3C)。各組大鼠背斜方肌EMG反應(yīng)見表1。

GroupEMG(%) 123 BK 100.0±0.099.3±0.798.6±0.7BK+EA100.0±0.048.3±0.8?BK+Methysergide100.0±0.097.7±0.3BK+EA+Methysergide100.0±0.048.0±0.7?81.2±0.8?#BK+EA+Vehicl100.0±0.048.1±1.0?50.4±1.1?

EMG： Electromyogram; BK： Bradykinin; EA： Electroacupuncture

*P<0.05vs1;#P<0.05vs2

3 討論

現(xiàn)在已明確，心臟的疼痛主要產(chǎn)生于化學(xué)性刺激并非機械性刺激，心肌缺血時BK、5-HT、腺苷和前列腺素等的釋放可引發(fā)痛覺。Jou及我們前期的研究表明大鼠心包內(nèi)注射致痛物質(zhì)(包括BK、辣椒素)，激活伴隨心交感神經(jīng)走行的心感覺傳入神經(jīng)纖維，該纖維進入T3～T5脊髓節(jié)段，激活痛反應(yīng)神經(jīng)元的活動，繼而引起心臟-軀體運動反射，該反射以背斜方肌EMG為觀測指標(biāo)[13-15]。臨床研究也證明心臟功能異常能夠引起繼發(fā)性肌肉收縮和/或肌張力增加[16,17]。因此，本研究以背斜肌EMG作為大鼠心臟傷害性感受痛反應(yīng)指標(biāo)。結(jié)果表明，電針內(nèi)關(guān)穴抑制心包內(nèi)注射BK誘發(fā)的背斜方肌EMG反應(yīng)，表明電針內(nèi)關(guān)穴能夠抑制心臟傷害性感受，這與臨床上電針內(nèi)關(guān)穴能夠緩解心絞痛病人疼痛的研究結(jié)果相一致[3]。

現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)研究認(rèn)為針刺鎮(zhèn)痛是由于針刺信息激活內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng)，在各級中樞水平上與傷害性刺激信息相互作用、相互整合，抑制傷害性刺激的傳入信息，從而實現(xiàn)鎮(zhèn)痛。5-HT是針刺經(jīng)絡(luò)腧穴后，信號傳入的中樞調(diào)控物質(zhì)之一，在痛覺調(diào)控中發(fā)揮重要作用[9-11]。脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的低級中樞，是痛覺信息加工、處理的第一站。電針穴位提高脊髓內(nèi)5-HT的含量，既可通過突觸后抑制方式抑制脊髓后角傷害性神經(jīng)元活動，也可通過中間神經(jīng)元的介導(dǎo)來阻斷傷害性信息的傳遞，下調(diào)或阻斷脊髓水平5-HT受體可能翻轉(zhuǎn)針刺的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。然而，5-HT對脊髓傷害性反應(yīng)的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的，可能產(chǎn)生抑制作用，也有可能產(chǎn)生易化作用[18]。這與5-HT激活的受體亞型不同、受體拮抗劑選用不同或者傷害性刺激類型不同有關(guān)。

有研究顯示脊髓內(nèi)的5-HT1、5-HT2和5-HT3受體與鎮(zhèn)痛效應(yīng)有關(guān)[19,20]。脊髓水平5-HT受體參與針刺鎮(zhèn)痛以往重要集中在軀體痛覺的研究[21]，對于內(nèi)臟痛覺尤其是心臟痛覺的研究甚少,這部分歸因于心臟痛覺模型復(fù)制困難。本研究在Jou建立的大鼠心臟傷害性感受模型基礎(chǔ)之上，鞘內(nèi)注射5-HT受體拮抗劑—麥角新堿部分翻轉(zhuǎn)電針內(nèi)關(guān)穴對背斜方肌EMG的抑制作用，而鞘內(nèi)注射溶媒對背斜方肌EMG無影響，提示脊髓水平5-HT和它的受體參與電針內(nèi)關(guān)穴對心臟傷害性感受的抑制調(diào)控作用。要想明確5-HT受體何種亞型在電針內(nèi)關(guān)穴對心臟傷害性感受的抑制調(diào)控中發(fā)揮重要作用，還需借助特異性更高的5-HT受體拮抗劑進行下一步研究。