花青素對完全弗氏佐劑誘導(dǎo)慢性炎性痛的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制*

王 靜， 陳澤峰， 和春霞， 王莉莉， 鄭嘉慧， 張 皓， 王占磊， 魯亞平

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 2. 皖南醫(yī)學(xué)院2013級臨床專業(yè)， 3. 皖南醫(yī)學(xué)院2015級臨床專業(yè)， 4. 皖南醫(yī)學(xué)院2014級麻醉專業(yè), 安徽 蕪湖 241002； 5. 安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 安徽 蕪湖 241002)

慢性痛已成為影響人類勞動能力和生存質(zhì)量的最普通、最直接的因素，但關(guān)于慢性痛的機(jī)制尚不十分明確，天然而副作用小的鎮(zhèn)痛藥物也有待開發(fā)。研究證實(shí)，瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid type1， TRPV1)同時(shí)參與慢性痛外周敏化和疼痛中樞調(diào)控，在慢性炎性痛中具有重要作用[1,2]。

花青素是一類廣泛存在于高等植物的果實(shí)、花、莖等器官中的黃酮類化合物，已有研究發(fā)現(xiàn)花青素具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗衰老、抗癌作用以及對肝臟、心腦血管和視力的保護(hù)作用[3-5]。本課題組前期研究結(jié)果已證實(shí)花青素具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，金葉女貞果實(shí)花青素能抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，抑制醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的增加，抑制棉球所致肉芽腫增生，提高小鼠熱痛閾，降低醋酸致小鼠扭體次數(shù)，其抗炎鎮(zhèn)痛機(jī)制與增強(qiáng)小鼠抗氧化能力和降低炎性因子NO和PGE2生成有關(guān)[6,7]。

炎性痛模型有：福爾馬林炎性痛模型，弗氏佐劑炎性痛模型(分為多發(fā)性佐劑炎性痛模型和單發(fā)性佐劑炎性痛模型)，角叉菜膠炎性痛模型，蜂蜜毒炎性痛模型，松節(jié)油炎性痛模型。福爾馬林模型和角叉菜膠模型常用于急性和亞急性炎癥模型。弗氏佐劑、蜂蜜毒、松節(jié)油常用于誘導(dǎo)慢性炎性痛模型，蜂蜜毒誘導(dǎo)的炎性痛呈現(xiàn)多種疼痛表現(xiàn)型，多發(fā)性弗氏佐劑誘導(dǎo)的模型病變范圍較廣，涉及多器官系統(tǒng)免疫性病變，適合于進(jìn)行抗類風(fēng)濕的藥物研究和自身免疫性疾病的研究。單發(fā)性佐劑炎性痛模型克服了多發(fā)性佐劑關(guān)節(jié)炎模型的缺點(diǎn)，將弗氏佐劑注入足底皮下而非足內(nèi)，造成局部組織周圍炎癥，痛覺過敏持續(xù)2～3周，是目前最常用的經(jīng)典慢性炎性痛模型[8]。本研究擬用單發(fā)性佐劑炎性痛模型(完全弗氏佐劑)誘導(dǎo)經(jīng)典慢性炎性痛大鼠模型，觀察花青素對慢性炎性痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用，分析其對慢性炎性痛大鼠炎性因子的釋放及中樞海馬區(qū)TRPV1表達(dá)的影響，試圖闡明金葉女貞果實(shí)花青素抗炎鎮(zhèn)痛作用可能的中樞機(jī)制，為鎮(zhèn)痛中藥的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)20080033。30只大鼠隨機(jī)分為三組(n=10)：(1)生理鹽水對照組(normal saline control group, NS), 左后肢足底注射生理鹽水100 μl；(2)慢性炎性痛模型組(chronic inflammatory pain model, Mod)，左后肢足底中部注射完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant, CFA)100 μl復(fù)制慢性炎性痛模型；(3)花青素治療組(anthocyanin treatment, Ant)，左后肢足底注射CFA 100 μl，同天開始灌胃給藥花青素(純花青素粉末用生理鹽水配制，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定給藥濃度90 mg·kg-1)連續(xù)給藥14 d。

1.2 主要儀器與試劑

PL-200熱刺痛儀(成都泰盟科技有限公司)，BW-YLS-3E 電子壓痛儀(上海軟隆科技)，YLS-7B足趾容積測量儀(上海軟隆科技)，UV-3200PCS紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器)，Model-680型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)。完全弗氏佐劑(sigma)。

1.3 花青素的提取與純化

金葉女貞果實(shí)經(jīng)篩選、清洗后置于烘箱中，50℃烘干至恒重，粉碎過80目篩，加75%的乙醇(料液比1∶15)經(jīng)微波化學(xué)反應(yīng)器提取，提取液抽濾去除濾渣得粗提液。粗提液經(jīng)DM130大孔樹脂柱吸附，吸附完全后，以大量的蒸餾水沖柱去糖，再經(jīng)石油醚萃取去脂類，得到去糖去脂花青素，最后置于凍干機(jī)中凍干，得到純花青素粉末，使用時(shí)用生理鹽水配置的花青素溶液。

1.4 慢性炎性痛模型建立

完全弗氏佐劑(complete Freund’S adjuvant，CFA)是一種常用的致炎劑，能夠造成注射局部炎癥，從而引起傷害性反應(yīng)，是建立慢性炎癥痛模型最常用的藥物。具體操作：消毒大鼠左側(cè)后肢及足底，經(jīng)足底皮下注射CFA100 μl，注射后按壓數(shù)分鐘，促進(jìn)藥物吸收。造模成功標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)文獻(xiàn)[9]判定。

1.5 行為學(xué)觀察

1.5.1 大鼠體重監(jiān)測 實(shí)驗(yàn)開始前(記作T0)和術(shù)后第1、3、5——13日(記作T1、T3、T5——T13)相同時(shí)間點(diǎn)測量各組大鼠體重。

1.5.2 足趾容積測量 用足趾容積測量儀在實(shí)驗(yàn)開始前(T0)和術(shù)后第1、3、5——13日(T1、T3、T5——T13)相同時(shí)間點(diǎn)測量大鼠左側(cè)后足趾容積。

1.5.3 熱痛閾值檢測 清醒大鼠放入測試箱中，室溫、安靜狀態(tài)下熱刺痛儀熱光源分別照射大鼠左足底部，當(dāng)大鼠出現(xiàn)抬足、舔腳反應(yīng)時(shí)的時(shí)間為熱痛閾(Heat pain threshold，HPT)。當(dāng)時(shí)間達(dá)到30 s，而大鼠仍無反應(yīng)時(shí)便停止照射，以免損傷皮膚，并以30 s作為最高痛閾。痛閾測定時(shí)每組循環(huán)測定3次，兩次時(shí)間間隔大于5 min，取3次的平均值作為HPT。各組大鼠均于CFA術(shù)前、術(shù)后第1、3、5、——13日測定HPT。

1.5.4 機(jī)械痛閾值檢測 清醒大鼠在室溫、安靜狀態(tài)下,將左側(cè)后肢足背部置于壓痛儀硅板上，并在足背部皮膚做一標(biāo)記，腳踩踏板增加壓爪強(qiáng)度，當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮腿、掙扎、嘶叫時(shí)，踩下踏板，此時(shí)壓強(qiáng)為機(jī)械壓痛閾值(mechanical pain threshold, MPT)。當(dāng)壓力達(dá)到250 g，而大鼠仍無反應(yīng)時(shí)便停止壓爪，以免損傷皮膚，并以250 g作為最高痛閾。痛閾測定時(shí)每組循環(huán)測定3次，2次時(shí)間間隔大于5 min，取3次的平均值作為MPT。各組大鼠均于CFA術(shù)前、術(shù)后第1、3、5——13日測定MPT。

1.6 檢測方法

術(shù)后第14日實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取動物血清，比色法測定血清SOD、NO、MDA和PGE2含量，具體方法按試劑盒說明進(jìn)行。另取海馬區(qū)組織迅速置于液氮中保存，使用前冰上解凍組織，按照每10 mg組織加入100 μl裂解液的比例加入加RIPA裂解液。用超聲破碎儀在冰上進(jìn)行超聲勻漿，直至充分裂解，然后12 000 r/min離心20 min，取上清按一定比例與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min，冰上迅速冷卻后-20℃儲存。Western blot實(shí)驗(yàn)取樣品20 μl經(jīng)SDS-PAGE→轉(zhuǎn)膜→封閉→一抗孵育→二抗孵育→顯影→洗脫→拍照→條帶分析。分析海馬區(qū)p-TRPV1和TRPV1蛋白的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 花青素對慢性炎性痛大鼠體重的影響

表1顯示三組大鼠體重在實(shí)驗(yàn)的兩周內(nèi)均呈緩慢增長趨勢，各組間沒有明顯差異。

2.2 花青素對慢性炎性痛大鼠足趾容積的影響

表2顯示：與NS相比，Mod組和Ant組在術(shù)后第1日，足趾容積明顯增大(P<0.05), 術(shù)后第3日足趾腫脹最明顯(P<0.01)，隨后足趾腫脹度逐漸緩解，但與NS組相比一直有明顯差異(P<0.01)； 在術(shù)后第7日，Ant組足趾容積顯著低于Mod組(P<0.05)。

2.3 模型組大鼠左后側(cè)足趾腫脹度監(jiān)測

圖1顯示的是NS，Mod，Ant三組大鼠在術(shù)后第1、5、9、13日后肢足趾照片。NS組大鼠左后足趾沒有出現(xiàn)腫脹；Mod組大鼠左后足趾明顯出現(xiàn)腫脹并一直持續(xù)14 d；Ant組大鼠左后足趾也出現(xiàn)明顯腫脹，但后期逐漸緩解，具體各組大鼠左后足趾容積見表2。

2.4 花青素對慢性炎性痛大鼠熱痛閾的影響

表3顯示各組在術(shù)前熱痛閾值沒有明顯差異，與NS組相比，術(shù)后第3日Mod組和Ant組熱痛閾值降低最為顯著(P<0.01)，隨后熱痛閾緩慢上升，術(shù)后第7日，Ant組的熱痛閾開始接近NS組，且Ant組的熱痛閾明顯高于Mod組(P<0.05)。

Fig.1Hind toes in each group after operation (T1，T5，T9，T13 mean 1，5，9，13 days after operation)

2.5 花青素對慢性炎性痛大鼠機(jī)械痛閾的影響

表4顯示：與NS組比較，Mod組和Ant組大鼠機(jī)械痛閾值在術(shù)后第3日出現(xiàn)明顯降低(P<0.01)，Mod組在術(shù)后第11日機(jī)械痛閾值有所緩解，Ant組在術(shù)后第7日機(jī)械痛閾值開始上升。在術(shù)后第9日，Ant組的機(jī)械痛閾值開始明顯高于Mod組(P<0.05)。

2.6 花青素對慢性炎性痛大鼠血清生化指標(biāo)的影響

表5顯示，與NS組比較，Mod組大鼠血清中SOD水平降低(P<0.05)，MDA、NO和PGE2水平明顯升高(P<0.01)；與Mod組比較，Ant組大鼠血清中SOD含量升高(P<0.01)，MDA、NO和PGE2含量有所降低(P<0.05)。

2.7 花青素對慢性炎性痛大鼠海馬區(qū)TRPV1表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與NS組比較，Mod組和Ant組大鼠海馬區(qū)總TRPV1和p-TRPV1表達(dá)均顯著提高(P<0.01，P<0.05)；與Mod組比較，Ant組大鼠海馬區(qū)p-TRPV1表達(dá)降低(P<0.05，圖2，表6)。

Fig.2Effects of anthocyanin on the expressions of TRPV1 and p-TRPV1 in hippocampus of rats with chronic inflammatory pain

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

Tab. 1 Effects of anthocyanin on body weight in rats with chronic inflammatory pain(g， n=10)

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

Tab. 2 Effects of anthocyanin on toe volume in rats with chronic inflammatory pain(ml， n=10)

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsMod group

Tab. 3 Effects of anthocyanin on heat pain threshold in rats with chronic inflammatory pain(s， n=10)

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsMod group

Tab. 4 Effects of anthocyanin on mechanical pain threshold in rats with chronic inflammatory pain(g， n=10)

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsMod group

Tab. 5 Effects of anthocyanin on serum levels of SOD, MDA, NO and PGE2 in rats with chronic inflammatory n=10)

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05 ,##P<0.01vsMod group

GroupTRPV1p-TRPV1NS 11Mod2.86±0.02??2.04±0.01??Ant2.52±0.01??1.42±0.01?#

NS: Normal saline control group; Mod: Chronic inflammatory pain model; Ant: Anthocyanin treatment group

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsMod group

3 討論

本研究中用到的花青素來自金葉女貞果實(shí)，金葉女貞是一種常見木犀科半綠小灌木，易栽培，果實(shí)產(chǎn)量高且含豐富的花青素，相比藍(lán)莓，葡萄籽中花青素獲得更加低廉便捷。本研究通過完全弗氏佐劑成功誘導(dǎo)經(jīng)典的慢性炎性痛大鼠模型，且炎性痛持續(xù)14 d，經(jīng)金葉女貞果實(shí)花青素溶液灌胃14 d，提高大鼠熱痛閾和機(jī)械痛閾(P<0.05)，降低足趾腫脹度(P<0.05)，說明花青素對慢性炎性痛大鼠有鎮(zhèn)痛作用。分析其機(jī)制可能與花青素提高大鼠抗氧化能力，減少炎性因子MDA、NO和PGE2的生成有關(guān)。SOD的作用是清除體內(nèi)的氧自由基，減少自由基對細(xì)胞的破壞，可以反映自由基的損害程度[10]。NO通過促進(jìn)血管舒張、形成水腫和增加炎性滲出從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，同時(shí)NO作為中樞遞質(zhì)或第二信使可以直接或間接的激活TRPV通道，起到痛覺增敏效應(yīng)[11,12]。內(nèi)源性PGE2可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)熱痛覺過敏癥狀，溴烯醇內(nèi)酯抑制 PGE2的合成，能夠減輕角叉菜椒誘發(fā)的痛覺過敏。研究發(fā)現(xiàn)PGE2通過 EP1受體，磷酸化TRPV1，從而增強(qiáng)TRPV1的功能活性[13]。

疼痛的發(fā)生有外周痛覺感受器，感覺神經(jīng)傳入系統(tǒng)及多個(gè)腦區(qū)的共同參與，尤其是海馬[14]。關(guān)于慢性痛機(jī)制的研究，主要圍繞外周傷害性感受器和痛覺中樞兩個(gè)水平展開。研究表明，TRPV1是位于細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上的一類非選擇性陽離子通道,既存在于外周傷害性感受器又存在于痛覺中樞(海馬，藍(lán)斑，下丘腦)。TRPV1可被熱(> 43℃)、酸(pH<5.9)、辣椒素等激活，引起陽離子Ca2+，Na+內(nèi)流(PCa/Na≈10)，從而促進(jìn)神經(jīng)元的興奮，參與痛覺信號的傳遞。局部炎癥介質(zhì)如緩激肽、前列腺素E2、神經(jīng)生長因子和 ATP 等刺激可使TRPV1發(fā)生功能敏化，表現(xiàn)出激活閾值下降、通道電流增大和膜定位增多等現(xiàn)象[15-17]。TRPV1基因敲除小鼠對傷害性熱刺激的反應(yīng)性顯著降低，尤其是炎癥痛模型鼠的熱痛覺敏化行為顯著減弱[18,19]。Eid[20]等研究發(fā)現(xiàn)給大鼠口服TRPV1特異性阻斷劑可降低動物對神經(jīng)性疼痛的反應(yīng)。TRPV1的激活是與配體結(jié)合引起片段的磷酸化而進(jìn)一步活化，受體磷酸化增加不僅增強(qiáng)受體在細(xì)胞表面的穩(wěn)定表達(dá),而且增加通道開放的可能性。我們的結(jié)果顯示，花青素降低中樞海馬區(qū)p-TRPV1/TRPV1的比例，說明花青素降低足趾腫脹度，增強(qiáng)痛閾，可能與下調(diào)TRPV1的磷酸化水平有關(guān)。

本研究證實(shí)金葉女貞果實(shí)花青素對完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的慢性炎性痛有鎮(zhèn)痛消腫作用，分析其機(jī)制可能與金葉女貞果實(shí)花青素降低炎性因子的釋放，增強(qiáng)抗氧化能力有關(guān)；同時(shí)金葉女貞果實(shí)花青素降低中樞海馬區(qū)p-TRPV1/TRPV1的比例，說明花青素的鎮(zhèn)痛作用可能與TRPV1的磷酸化水平有關(guān)，但是花青素是直接作用于TRPV1通道，還是通過炎性因子間接作用于TRPV1通道，我們將做深入研究。金葉女貞果實(shí)花青素作為一種廉價(jià)易得的高效抗氧化劑，如能明確其鎮(zhèn)痛機(jī)制，將為無副作用的鎮(zhèn)痛中藥篩選提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。