氯通道在葛根素注射液致溶血反應(yīng)中的作用*

蔣奉奇， 袁 瑩， 向祚君， 黃攀蕊， 鄔 赫， 王詩琪， 王 娟 ，彭 暉， 羅 海

(1. 湖南醫(yī)藥學院生理學教研室， 2. 湖南醫(yī)藥學院臨床技能實訓(xùn)中心， 懷化 418000)

葛根素注射液(puerarin injection)是一類藥理作用廣泛的中藥單體注射劑，臨床常用于輔助治療冠心病、心絞痛、心肌梗死、糖尿病及其并發(fā)癥等[1-3]。該藥自1993年上市以來，已有多例引起急性血管內(nèi)溶血的報道，嚴重者可因器官功能衰竭而死亡[4]。目前，葛根素注射液致溶血反應(yīng)的機制仍不明確。文獻報道，葛根素注射液溶血反應(yīng)屬藥源性非免疫性溶血，可能與葛根素影響紅細胞滲透壓、改變紅細胞形態(tài)以及降低紅細胞膜穩(wěn)定性有關(guān)[5-7]。

氯通道在紅細胞膜表面大量表達，可通過影響Cl-、有機滲透物、水等物質(zhì)跨細胞膜轉(zhuǎn)運，影響細胞內(nèi)外滲透壓，進而調(diào)控細胞容積穩(wěn)定[8]。葛根素注射液溶血作用是否與氯通道調(diào)控途徑相關(guān)，國內(nèi)外尚無文獻報道。本文旨在探討氯通道在葛根素注射液致溶血反應(yīng)中的作用，為基于離子通道途徑防治葛根素注射液溶血反應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

葛根素注射液(方明藥業(yè)集團，產(chǎn)品批號1511217)內(nèi)含葛根素100 mg/2 ml，作為母液常溫保存。使用時用生理鹽水(NS)稀釋到工作濃度。氯通道阻斷劑他莫昔芬(Tamoxifen，Tam)購自Sigma-Aldrich公司(貨號T5648)，用甲醇配制成50 mmol/L儲存液常溫保存，使用時稀釋至20 μmol/L。ATP注射液(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品批號41603228)含三磷酸腺苷二鈉20 mg/ml，做氯通道阻斷劑使用時稀釋成10 mmol/L，做氯通道激動劑使用時稀釋成50 μmol/L，實驗當天配制。

1.2 紅細胞懸液的制備

心臟穿刺采集健康日本大耳白兔新鮮全血5 ml，肝素鈉(1000 IU/ml)250 μl抗凝。使用低速離心機(TD5A，長沙湘儀)1 500 r/min離心5 min，吸去血漿層，加入生理鹽水(NS)混勻。再以同樣轉(zhuǎn)速離心，重復(fù) 3 次，直至離心后上清液透亮。去掉上清液，然后取 20 μl壓積紅細胞用NS稀釋至 1 ml混勻，得到2%紅細胞懸液用于實驗。

1.3 實驗分組

實驗分組⑴葛根素注射液組：葛根素注射液濃度分別為0.75、1.5、3、6 和12 mg/ml；⑵葛根素注射液 + 氯通道阻斷劑組：3 mg/ml葛根素注射液 + 20 μmol/L Tam組、3 mg/ml葛根素注射液 + 10 mmol/L ATP組；⑶葛根素注射液 + 氯通道激動劑組：3 mg/ml葛根素注射液 + 50 μmol/L ATP；⑷生理鹽水陰性對照組；⑸蒸餾水陽性對照組；⑹藥物自身對照組：20 μmol/L Tam組、10 mmol/L ATP組、50 μmol/L ATP組。每組采集3個以上樣本進行重復(fù)。將上述各組樣品放入37℃恒溫水浴箱(DK-98-Ⅱ，天津泰斯特)孵育6 h。

1.4 紅細胞溶血率的檢測與計算

孵育結(jié)束后，將各組樣品1 500 r/min離心5 min。小心取出上清液，搖勻，按150 μl/孔加入96孔板，每組設(shè)三個平行對照。使用酶標儀(LB942 ，德國Berthold)檢測540 nm吸光度，并按以下公式計算溶血百分率：溶血百分率=(OD 樣品-OD 陰性)/(OD 陽性-OD 陰性) ×100%。其中，OD 陽性表示蒸餾水組完全溶血的OD 值；OD 陰性表示NS組完全未溶血的OD 值；OD 樣品表示樣品某個濃度的OD 值。各組樣本去除上清液后剩余的細胞沉淀，加入NS稀釋至1 ml，取其中500 μl細胞懸液用于流式細胞儀(Cytoflex，美國Beckman)檢測溶血率；另外500 μl細胞懸液置于倒置顯微鏡(NIB-100F，寧波永新)下，使用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0，美國Media Cybernetics)拍攝并觀察紅細胞變化。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 葛根素注射液的濃度依賴性溶血作用

本實驗研究了5種不同濃度葛根素注射液對家兔紅細胞的影響。酶標儀檢測結(jié)果顯示(表1)，與NS組相比，0.75 mg/ml葛根素注射液組無明顯溶血作用(n=3,P> 0.05)；而當葛根素注射液提高至1.5 mg/ml時，溶血率為(7.45±0.71)%，表現(xiàn)出溶血效應(yīng)(n=3,P<0.05)；隨著葛根素注射液濃度增加，其溶血作用相應(yīng)增強(n=3，P<0.01)，3 mg/ml、6 mg/ml、12 mg/ml時溶血率分別為(17.16±3.32)% 、(33.44±5.40)% 、(57.76±6.62)%。這與樣品直接觀察及細胞圖像系統(tǒng)記錄的結(jié)果一致(圖1)。流式細胞儀檢測結(jié)果與此類似(圖2、表1)。上述結(jié)果均提示，一定濃度的葛根素注射液可誘導(dǎo)紅細胞體外溶血，且作用呈濃度依賴性。

Fig.1The hemolysis induced by puerarin injectioninvitro

Fig.2Flow cytometric analysis of hemolysis induced by different concentration of puerarin injection

A： NS group; B： 0.75 mg/ml puerarin injection group; C： 1.5 mg/ml puerarin injection group; D： 3 mg/ml puerarin injection group; E： 6 mg/ml puerarin injection group; F： 12 mg/ml puerarin injection group

GroupHemolytic percentage (%)Microplate readerFlow cytometryNS0.19±0.030.63±0.410.75 mg/ml puerarin injection0.39±0.060.80±0.341.5 mg/ml puerarin injection7.45±0.71?8.28±0.57?3 mg/ml puerarin injection17.16±3.32??##18.83±1.31??##6 mg/ml puerarin injection 33.44±5.40??ΔΔ34.35±3.45??ΔΔ12 mg/ml puerarin injection57.76±6.62??++56.93±7.28??▲▲

*P<0.05,**P<0.01vsNS group;##P<0.01vs1.5 mg/ml puerarin injection group;ΔΔP<0.01vs3 mg/ml puerarin injection group;▲▲P<0.01vs6 mg/ml puerarin injection group

2.2 氯通道阻斷劑抑制葛根素注射液的溶血作用

酶標儀、流式細胞儀檢測結(jié)果顯示(圖3、表2)，與3 mg/ml葛根素注射液組溶血率相比，3 mg/ml葛根素注射液 + 20 μmol/L Tam組(n=3)、3 mg/ml葛根素注射液 + 10 mmol/L ATP組(n=5)溶血率均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。這些結(jié)果提示，用氯通道阻斷劑關(guān)閉氯通道，可部分抑制葛根素注射液誘導(dǎo)的紅細胞溶血。

2.3 氯通道激動劑增強葛根素注射液的溶血作用

酶標儀、流式細胞儀分析結(jié)果顯示(圖3、表2)，與3 mg/ml葛根素注射液組溶血率相比，3 mg/ml葛根素注射液 + 50 μmol/L ATP組溶血率顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(n=4，P<0.01)。結(jié)果提示，用氯通道激動劑激活氯通道，可增強葛根素注射液誘導(dǎo)的紅細胞溶血。

Fig.3Flow cytometric analysis of hemolysis after treatment with chloride channel blockers and agonists

A： 3 mg/ml puerarin injection group; B： 3 mg/ml puerarin injection+20 μmol/L tamoxifen group; C： 3 mg/ml puerarin injection+10 mmol/L ATP group; D： 3 mg/ml puerarin injection+50 μmol/L ATP group

GroupnHemolytic percentage (%)Microplate readerFlow cytometry3 mg/ml puerarin injec-tion 317.16±3.3218.83±1.313 mg/ml puerarin injec-tion+20 μmol/L Tam 35.17±0.57??6.69±1.04??3 mg/ml puerarin injec-tion+10 mmol/L ATP 52.49±1.00??3.46±1.27??3 mg/ml puerarin injec-tion+50 μmol/L ATP 440.28±7.44??40.57±7.54??

**P<0.01vs3 mg/ml puerarin injection group

2.4 氯通道阻斷劑及激動劑藥物自身不誘導(dǎo)紅細胞溶血

為了觀察Tamoxifen、ATP藥物本身是否可引起紅細胞溶血，實驗同時設(shè)置單純相應(yīng)濃度藥物的自身對照組。細胞圖像記錄系統(tǒng)觀測發(fā)現(xiàn)(未顯示)，與NS組相比，20 μmol/L Tam組、50 μmol/L ATP組、10 mmol/L ATP組紅細胞數(shù)量和形態(tài)均無明顯改變。酶標儀檢測結(jié)果顯示，20 μmol/L Tam組、50 μmol/L ATP組、10 mmol/L ATP組溶血率分別為(0.26±0.11)%、(0.27±0.16)%、(0.31±0.08)%，均與NS組(0.19±0.03)%溶血率無明顯區(qū)別，差異無統(tǒng)計學意義(n=3，P> 0.05)。結(jié)果提示，實驗中使用的氯通道阻斷劑及激動劑自身對紅細胞無明顯影響，排除了藥物本身誘導(dǎo)紅細胞溶血的可能。

3 討論

葛根素注射液主要成分為葛根素，是一種從中藥葛根中分離得到的異黃酮類衍生物，其藥理活性較為廣泛，包括血管舒張、心臟保護、神經(jīng)保護、抗氧化、抗炎、抗腫瘤以及減弱胰島素抵抗等。然而，葛根素注射液的急性血管內(nèi)溶血等不良反應(yīng)嚴重影響了其臨床用藥安全。

近來有文獻報道，將膜穩(wěn)定劑牛磺酸與葛根素注射液配伍使用，可一定程度上對抗葛根素注射液引起的紅細胞形態(tài)異常和溶血反應(yīng)[9]。生理狀態(tài)下，?；撬崾遣溉閯游锛毎麅?nèi)與滲透壓調(diào)控密切相關(guān)的重要有機滲透物之一[10,11]。低滲溶液誘導(dǎo)細胞腫脹后，K+、Cl-等無機離子以及?；撬岬扔袡C滲透物可隨之流出，同時伴隨水的被動流出, 調(diào)節(jié)細胞容積，此機制被稱為調(diào)節(jié)性容積減小(regulatory volume decrease，RVD)。我們及其他實驗室的大量研究均證實，RVD過程中，細胞內(nèi)Cl-、?；撬岬热苜|(zhì)外流的主要機制為氯通道的激活[12-15]。那么，?；撬徂卓垢鸶刈⑸湟喝苎磻?yīng)的機制是否和氯通道調(diào)控途徑相關(guān)？氯通道在葛根素注射液致溶血反應(yīng)中有何作用？

本研究首先在體外觀察不同濃度葛根素注射液對家兔紅細胞的作用。文獻報道，葛根素注射液臨床常用輸液濃度約0.8 mg/ml，致溶血時最大輸液濃度約3 mg/ml[16]，故本實驗在0.75 mg/ml ～12 mg/ml范圍內(nèi)設(shè)置0.75、1.5、3、6、12 mg/ml共5個劑量。在實驗所觀察的劑量范圍內(nèi)，1.5 mg /ml葛根素注射液即可誘發(fā)一定程度的紅細胞溶血，且效應(yīng)隨葛根素注射液濃度增加而增強，表現(xiàn)為濃度依賴性(圖1、圖2、表1)。鑒于我們之前的研究，20 μmol/L Tamoxifen、10 mmol/L ATP可阻斷氯通道，而50 μmol/L ATP有激活氯通道的效應(yīng)[17]，在本實驗中我們觀察這些氯通道阻斷劑、激動劑對于臨床致溶血劑量(3 mg/ml)葛根素注射液溶血效應(yīng)的影響。使用氯通道阻斷劑20 μmol/L Tamoxifen、10 mmol/L ATP關(guān)閉氯通道，可部分抑制3 mg/ml葛根素注射液誘導(dǎo)的紅細胞溶血；而使用氯通道激動劑50 μmol/L ATP開放氯通道，則顯著增強3 mg/ml葛根素注射液的溶血效應(yīng)(圖3、表 2)。這些結(jié)果提示，葛根素注射液致溶血作用與氯通道激活密切相關(guān)。實驗中為了觀察Tamoxifen、ATP兩種藥物本身是否可引起紅細胞溶血，還同時設(shè)置了單純相應(yīng)濃度藥物的自身對照組。結(jié)果顯示，20 μmol/L Tamoxifen組、10 mmol/L ATP組、50 μmol/L ATP組與NS組相比紅細胞溶血率無明顯改變，基本排除這些藥物本身誘導(dǎo)紅細胞溶血反應(yīng)的可能。由此我們推測，前述文獻中提及的?；撬崤c葛根素注射液配伍使用，可能通過干預(yù)經(jīng)由氯通道途徑的?；撬峥缒まD(zhuǎn)運過程，進而產(chǎn)生拮抗葛根素注射液溶血反應(yīng)的效果。

綜上所述，本研究結(jié)果表明葛根素注射液可誘導(dǎo)家兔紅細胞體外溶血，作用呈濃度依賴性；氯通道激活與葛根素注射液誘導(dǎo)的溶血反應(yīng)密切相關(guān)。然而，氯通道有囊性纖維跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)體、鈣激活性氯通道、電壓門控氯通道、配體門控氯通道以及容積調(diào)節(jié)性氯通道等多種亞型[18]，何種類型的氯通道激活參與葛根素注射液誘導(dǎo)的溶血反應(yīng)，其分子機制如何本研究尚未涉及，有待后續(xù)實驗進一步探討。