scFv17改善12月齡三轉(zhuǎn)基因小鼠步態(tài)的作用*

王 婷， 曹 越， 胡夢明， 張秀敏， 董雪帆， 祁金順， 張 軍， 楊 威

(山西醫(yī)科大學生理學系， 細胞生理學省部共建教育部重點實驗室， 太原 030001)

目前全世界有4680萬人患有癡呆癥,這一數(shù)字估計到2050年會增加至1億3150萬，這將對社會和家庭帶來越來越重的負擔[1]。阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性、進行性、神經(jīng)退行性疾病[2]，AD 的主要臨床癥狀包括認知、記憶和精神行為方面的損害，典型的病理改變包括腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的老年斑(senile plaques, SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFT)以及突觸功能障礙和神經(jīng)元的丟失，SP的主要成分是有神經(jīng)毒性的淀粉樣β蛋白(amyloid β protein, Aβ)，NFT是由細胞內(nèi)過度磷酸化的tau蛋白形成的[2]。雖然AD的典型癥狀是進行性的認知和記憶損害，但是平衡和步態(tài)紊亂帶來的生活無法自理已經(jīng)干擾了老年人多年[3, 4]。AD病人摔倒風險較正常老年人要大，這些病人多數(shù)步幅長度縮短，步幅速度減慢，步間變異度增加[5, 6]。同時AD動物模型，APPswe /PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠以及PS1M146V/APPswe/tauP301L三轉(zhuǎn)基因小鼠(3xTg-AD)的步態(tài)變化也有文獻報道[7, 8]。但迄今為止，關(guān)于造成癡呆病人步態(tài)紊亂的病理原因還不清楚。

雖然大腦是AD病理影響的主要部位，但是有研究報道在小腦皮層的分子層和顆粒細胞層也有Aβ的散在沉積[9, 10]。除了Aβ沉積，AD病人小腦也同大腦半球一樣，體積縮小[11]。家族性阿爾茨海默病(familial Alzheimer’s disease,FAD)與散發(fā)性阿爾茨海默病(sporadic Alzheimer’s disease, SAD)相比，小腦浦肯野細胞明顯減少，而且反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增多[12]。小腦是控制機體運動協(xié)調(diào)性和平衡的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，小腦萎縮多由于浦肯野細胞死亡引起，而浦肯野細胞作為小腦皮層的唯一傳出神經(jīng)元，在小腦回路中扮演著中心作用，它的損害/退化表現(xiàn)為共濟失調(diào)、異常的肢體運動和步態(tài)[13, 14]。以上研究結(jié)果說明AD病人小腦存在同大腦相似的病理改變并可能參與步態(tài)紊亂的發(fā)展過程。但是目前為止，人們對AD的小腦病理關(guān)注甚少，特別是小腦以及小腦浦肯野細胞的變化對AD的步態(tài)影響更是鮮有報道。

Aβ一直被認為是免疫治療AD的重要靶點[15, 16]。目前關(guān)于Aβ免疫治療的研究雖然很多，但多集中在藥物對AD認知或精神障礙的相關(guān)作用，尚未有大量文獻報道藥物對AD步態(tài)的作用。我們實驗室利用噬菌體展示肽庫技術(shù)合成的scFv17抗體，是針對Aβ31-355個氨基酸序列作用的單鏈可變片段，能夠在清除Aβ的同時不會因為作用于Aβ的N端而增加可溶性Aβ寡聚體[17]，從而大大減輕了副反應(yīng)。本實驗將采用步態(tài)行為學和病理學實驗手段，觀察3xTg-AD小鼠步態(tài)變化，研究scFv17對3xTg-AD小鼠步態(tài)和相關(guān)小腦病理的影響，旨在為AD步態(tài)治療提供新策略及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗選用6月齡PS1M146V/APPswe/tauP301L(3x Tg-AD)小鼠和野生型 C57BL/6J (C57)對照小鼠，各24只，雌雄各半。其中，3xTg-AD小鼠購自美國JaksonLab，C57小鼠由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供。所有動物在本實驗室的獨立送風系統(tǒng)(IVC)動物房繁殖及飼養(yǎng)，動物房溫度為20～25 ℃，室內(nèi)保持12 h光照 -12 h 黑暗循環(huán)，并保證小鼠充足的進食和飲水提供。

1.2 實驗試劑

藥物單鏈抗體scFv17是上海生工生物工程有限公司根據(jù)我們給予的Aβ31-355個氨基酸序列經(jīng)過多肽合成→小鼠免疫及RNA提取→scFv重組抗體噬菌體抗體庫構(gòu)建→單鏈抗體文庫篩選→蛋白表達純化的過程制備生產(chǎn)而來。藥物溶解于pH=7.4的PBS中，終濃度為1.85 mg/ml，分裝后儲存于﹣80℃冰箱。在小鼠12月齡時，以鼻飼方式每次給予給藥組小鼠1.5 mg/kg的scFv17，即給藥組每只小鼠每次20 μl的scFv17滴鼻處理，對照組每只小鼠每次則給予同體積0.01 mol/L PBS。每周兩次，持續(xù)給藥12周后開始步態(tài)行為學測試。實驗中采用的抗體及主要試劑：尼氏染色液(碧云天，中國)；Biotin-羊抗兔IgG、Biotin-羊抗鼠IgG (博士德，中國)；Anti-β-Amyloid(6E10)抗體(BioLegend，美國)；Anti-Human PHF-Tau (AT8)抗體(Thermo Science，美國)等。

1.3 主要實驗儀器

步態(tài)分析儀器RunwayScan3.0平板步態(tài)分析系統(tǒng)(CleverSys Inc., Reston, VA, USA)、石蠟包埋機(EG1150H，Leica，德國)、石蠟切片機(RM2245，Leica，德國)、攤片機(KD-P，KEDEE，浙江，中國)、Scanscope數(shù)字病理切片掃描成像系統(tǒng)(Aperio，Leica，德國)等。

1.4 實驗分組及給藥

給與藥物單鏈抗體scFv17前，利用RunwayScan3.0平板步態(tài)分析系統(tǒng)對6月齡，9月齡和12月齡的3xTg-AD 小鼠和野生型 C57BL/6J (C57)對照小鼠進行步態(tài)變化監(jiān)測，12月齡時發(fā)現(xiàn)步態(tài)變化明顯，便將兩組不同的小鼠隨機分為WT給PBS (WT+PBS)、WT給藥(WT+scFv17)、3xTg-AD給PBS (3xTg-AD+PBS)以及3xTg-AD給藥(3xTg-AD+scFv17)四組。藥物溶解于pH 7.4的PBS中。在小鼠12月齡時，以鼻飼方式按照1.5 mg/kg/次的劑量將scFv17給予給藥組小鼠，即給藥組每只小鼠每次20 μl scFv17滴鼻處理，給PBS組每只小鼠每次則給予同體積0.01 mol/L PBS。每周兩次持續(xù)給藥12周后開始步態(tài)行為學測試。

1.5 步態(tài)行為測試

3xTg-AD實驗鼠和C57BL/6野生型鼠在20 s (2 000幀)內(nèi)2～3次自由通過暗環(huán)境中的長115 cm，寬6.5 cm的玻璃跑道，此期間其中一段設(shè)定好長度范圍(30 cm)的玻璃跑道的爪印被BcamCapture軟件采集并且由RunwayScan軟件分析。實驗前每只小鼠放至跑道中讓其探索習慣跑道以確保其每次必須連續(xù)無停頓地朝一個方向通過設(shè)定好的30 cm長度范圍玻璃跑道。RunwayScan3.0分析系統(tǒng)在識別并標記出每—個腳印后，將自動產(chǎn)生一系列步態(tài)參數(shù)，包括站立時間百分比(stance time percent)、邁步時間百分比(swing time percent)、兩后腳距離即后爪步幅寬度(rear track width)等，每個足至少采集到連續(xù)的11個腳印其參數(shù)才能被統(tǒng)計。因為步態(tài)參數(shù)會受體重影響而有所波動[18]，進行步態(tài)實驗之前，我們對每組的小鼠稱重，每只小鼠體重接近25±5 g。實驗過程中體重過大或者過小的鼠，在設(shè)定好30 cm長度范圍內(nèi)停頓、轉(zhuǎn)向或停滯不前的鼠，均不納入統(tǒng)計范圍。

1.6 小腦組織取材

步態(tài)行為學之后，WT+PBS組和WT+scFv17各取4只小鼠，3xTg-AD+PBS和3xTg-AD+scFv17各取3只小鼠，將其用5%的水合氯醛麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟和肝臟，將灌注針頭插入左心尖，同時剪開右心耳，先快后慢灌注30 ml 0.01 mol/L PBS后改灌30 ml的4%多聚甲醛，灌注結(jié)束后小鼠尾巴直立翹起，四肢僵硬，此時，斷頭，取下全腦放入4%多聚甲醛固定24 h。固定之后的全腦經(jīng)過修整，棄去大腦和小腦一側(cè)半球，將剩余小腦腦組織經(jīng)梯度酒精脫水，透明，矢狀面朝下浸蠟包埋。包埋好的蠟塊-20℃冰箱放置一段時間后進行連續(xù)矢狀位切片，厚度2 μm，每個腦組織選取4～6片小葉完整的腦片進行各項試驗。

1.7 HE染色

將小腦石蠟切片烘干后常規(guī)脫蠟至水,后用蘇木精水溶液染10 min，再經(jīng)鹽酸乙醇分化數(shù)秒,乙醇伊紅染色液染色5 min后脫水透明,封片。后經(jīng)Scanscope數(shù)字病理切片掃描成像系統(tǒng)掃描以及截圖，觀察比較小腦組織結(jié)構(gòu)變化。

1.8 尼氏染色

將烘干的小腦切片嚴格按照試劑盒的說明書進行脫蠟染色。脫蠟：二甲苯中脫蠟5～10 min，共三次，無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min；尼氏(Nissl)染色：尼氏染色液染色3～10 min，蒸餾水洗滌2次(每次數(shù)秒鐘即可)，95%乙醇約5 s；脫水、透明、封片：95%乙醇脫水2 min，換用新鮮的95%乙醇再脫水2 min，二甲苯透明5 min，換用新鮮的二甲苯，再透明5 min，用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，細胞呈現(xiàn)斑駁的藍紫色染色。晾干的片子經(jīng)Scanscope數(shù)字病理切片掃描成像系統(tǒng)掃描、截圖、處理，每張小腦腦片選取4～5個區(qū)域，進行尼氏染色陽性細胞計數(shù)，最后取一張腦片的平均計數(shù)，并比較單位長度尼氏染色陽性細胞數(shù)。

1.9 免疫組化

石蠟切片置60℃烤箱烘烤2 h后常規(guī)脫蠟至水；蒸餾水洗2次，各2 min；微波修復(fù)抗原：將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，放置在微波爐中加熱至沸騰，冷卻至室溫；0.01 mol/L PBS洗滌，2 min×2次；3% H2O2溶液阻斷過氧化物酶， 10 min；0.01 mol/L PBS洗2 min×2次；血清封閉30 min；棄去血清，滴加適當比例(6E10為1∶500、 AT8為1∶30)稀釋的一抗，4℃冰箱過夜；室溫放置1 h，PBS洗2 min×2次；滴加二抗，37℃孵育30 min；PBS洗2 min×2次；滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素三抗，37℃反應(yīng)20 min；PBS洗2 min×2次；DAB 顯色1～2 min，蒸餾水終止顯色后充分水洗。蘇木素常規(guī)復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，陰涼通風處存放。晾干的片子經(jīng)Scanscope數(shù)字病理切片掃描成像系統(tǒng)掃描、截圖后采用Image-Pro-Plus 6.0軟件處理分析，針對小腦蚓部6E10反應(yīng)陽性的Aβ 斑塊進行計數(shù)，而對AT8反應(yīng)陽性的浦肯野細胞進行灰度值測定，最后比較單位面積的Aβ 斑塊數(shù)目及NFT的相對光密度值。

1.10 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。多組間均數(shù)顯著性檢驗應(yīng)用One-Way ANOVA，其中方差齊性資料采用LSD檢驗進行兩兩組間比較；非齊性資料用Tamhane’S T2檢驗。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤表示。作圖使用Sigmaplot 10.0 軟件。

2 結(jié)果

2.1 12月齡3xTg-AD小鼠運動協(xié)調(diào)和平衡能力觀察

平步步態(tài)行為測試可以檢測小鼠的運動協(xié)調(diào)和平衡能力。本研究發(fā)現(xiàn)(表1)，6 月齡、9月齡、12月齡 WT組小鼠的后爪步幅寬度(rear track width)無顯著差異(P>0.05)；12月齡的3xTg-AD小鼠相對于6、9月齡的3xTg-AD小鼠來講，后爪步幅寬度更寬(P<0.01)；此外，和同月齡WT組小鼠相比，12月齡的3xTg-AD小鼠的后爪步幅寬度明顯增寬(P<0.01)。本研究還發(fā)現(xiàn)(表1)，6、9、12月齡WT組小鼠的站立時間百分比(stance time percent)和搖擺時間百分比(swing time percent)無顯著差異(P> 0.05)；12月齡3xTg-AD小鼠相比6、9月齡的3xTg-AD小鼠站立時間百分比更大(P<0.01)，搖擺時間百分比更小(P<0.01)；6月齡的WT組小鼠和3xTg-AD小鼠相比，兩個百分比無顯著差異(P> 0.05)，9月齡的3xTg-AD小鼠的站立時間百分比和搖擺時間百分比與WT組小鼠的相比也無顯著差異(P> 0.05)，然而12月齡的3xTg-AD小鼠的搖擺時間百分比明顯低于同月齡WT組小鼠(P<0.01)，站立時間百分比明顯高于同月齡的WT組小鼠(P< 0.01)。以上結(jié)果表明3xTg-AD小鼠可能在12月齡時運動協(xié)調(diào)和平衡能力出現(xiàn)嚴重損傷。

GroupRear track width(mm)Stance time percent(%)Swing time percent(%)6 months old WT46.09±1.2239.55±2.1160.45±2.116 months old 3xTg-AD47.99±1.3841.27±1.0759.22±0.949 months old WT47.99±1.3843.12±1.3556.85±1.369 months old 3xTg-AD46.16±0.8541.21±1.6454.55±1.9212 months old WT51.21±1.2744.71±1.8654.55±0.7612 months old 3xTg-AD60.35±1.31??##52.37±2.24??##41.21±1.67??##

**P<0.01vs9 months old 3xTg-AD group；##P<0.01vs12 months old WT group

2.2 scFv17對12月齡3xTg-AD小鼠運動協(xié)調(diào)和平衡能力的作用

與WT+PBS組相比較，3xTg-AD+PBS組小鼠的后爪步幅寬度明顯增寬(P<0.01)；WT+scFv17組的后爪步幅寬度與WT+PBS組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但3xTg-AD+ scFv17組的后爪步幅寬度明顯小于3xTg-AD+PBS組(P<0.05，圖1，表2，圖1見彩圖頁Ⅰ)。3xTg-AD+PBS組小鼠相比WT+PBS組，站立時間百分比明顯增大(P<0.01)，而搖擺時間百分比明顯減小(P<0.01)；WT +scFv17組的兩個時間百分比參數(shù)與WT+PBS組的無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但經(jīng)scFv17治療后的3xTg-AD小鼠站立時間百分比明顯小于3xTg-AD+PBS組(P< 0.01)，搖擺時間百分比明顯大于3xTg-AD+PBS組(P< 0.01)。以上結(jié)果表明慢性給予scFv17可以改善大月齡的3xTg-AD小鼠出現(xiàn)的運動協(xié)調(diào)和平衡能力障礙。

GroupRear track width( mm)Stance time percent(%)Swing time percent(%)WT+PBS53.06±1.1431.75±1.0658.26±1.063xTg-AD+PBS63.28±1.31??44.61±1.85??43.17±2.96??WT+scFv1755.50±1.4737.31±2.5852.69±2.583xTg-AD+ scFv1758.98±1.57#34.07±2.37##56.77±2.39##

**P<0.01vsWT+PBS group；#P<0.05，##P<0.01vs3xTg-AD+PBS group

2.3 scFv17對3xTg-AD小鼠小腦浦肯野細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

WT+scFv17組和WT+PBS組小鼠的小腦浦肯野細胞排列整齊密集，細胞結(jié)構(gòu)清晰，胞漿紅染胞核藍染，胞核圓形或橢圓形，核仁清晰，形態(tài)正常；3xTg-AD+PBS組小鼠的小腦浦肯野細胞排列比較稀疏，輪廓模糊，凋亡細胞多，經(jīng)scFv17治療后的3xTg-AD小鼠細胞凋亡程度輕，形態(tài)較3xTg-AD+PBS組小鼠有所改善(圖2，見彩圖頁Ⅰ)。

2.4 scFv17對3xTg-AD小鼠小腦浦肯野細胞損傷的作用

WT+PBS組小鼠的小腦浦肯野細胞排列規(guī)則緊密，胞漿尼氏體染色清晰可辨,受染后呈塊狀,尼氏體大而數(shù)量豐富；3xTg-AD+PBS組小鼠的小腦浦肯野細胞胞漿尼氏體減少甚至消失,表現(xiàn)為尼氏體細胞質(zhì)著色淺,胞體腫脹；WT+scFv17組和WT+PBS組小鼠無明顯差別；但經(jīng)scFv17鼻飼治療后的3xTg-AD+scFv17組小腦蒲肯野細胞胞漿尼氏小體數(shù)目明顯增多(圖3，見彩圖頁Ⅱ)。3xTg-AD+PBS組與WT+PBS組相比，浦肯野細胞密度明顯降低(P<0.01)；WT+scFv17組和WT+PBS組的細胞密度沒有顯著差異(P>0.05)，但scFv17明顯上調(diào)了3xTg-AD+ scFv17組浦肯野細胞的數(shù)目(P<0.01，表3)。尼氏小體與神經(jīng)元蛋白合成功能密切相關(guān)，3xTg-AD的相關(guān)病理損害小腦浦肯野細胞胞漿的尼氏小體，繼而干擾其蛋白合成功能，但是單鏈抗體scFv17有效地改善了這一變化。

2.5 scFv17對3xTg-AD小鼠小腦皮層內(nèi)Aβ斑塊的影響

Aβ斑塊沉積是AD的典型病理特征，大量文獻證明AD患者和AD轉(zhuǎn)基因鼠的小腦中有Aβ斑塊沉積。scFv17是抗Aβ31-35片段單鏈抗體，能夠有效清除腦內(nèi)Aβ斑塊沉積。WT組給予PBS和scFv17藥物的小鼠小腦未見明顯的Aβ斑沉積；而3xTg-AD+PBS組小腦內(nèi)可見明顯的6E10染色陽性斑塊，且斑塊主要沉積在浦肯野細胞(PCs)層附近(圖4，見彩圖頁Ⅱ)。較WT+PBS組相比，3xTg-AD+PBS組Aβ斑塊數(shù)量明顯增多(P<0.01)。而慢性鼻飼scFv17后，3xTg-AD小腦內(nèi)Aβ斑塊沉積明顯減少(P<0.01，表3)。

2.6 scFv17對3xTg-AD小鼠小腦浦肯野細胞層神經(jīng)原纖維纏結(jié)的影響

Aβ斑塊作為AD的典型病理特征，它的沉積可以引發(fā)tau蛋白的過度磷酸化，繼而聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)。上述實驗已證明scFv17有效地減少3xTg-AD小腦內(nèi)的Aβ斑塊數(shù)量，我們想進一步驗證scFv17是否可以減少浦肯野細胞內(nèi)NFT的表達。WT+PBS組和WT+scFv17組PCs內(nèi)幾乎不存在神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)(P>0.05)；但是相對于WT+PBS組3xTg-AD+PBS組小腦PCs存在大量的NFT(P<0.01)；單鏈抗體治療組3xTg-AD+scFv17組的PCs內(nèi)的NFT大幅度減少(P<0.01)(圖5，表3，圖5見彩圖頁Ⅲ)，提示scFv17明顯減少了PCs內(nèi)的NFT。

GroupDensity of Purkinje cells (PCs) stained by Nissl staining(n/μm)Number of Aβ plaques in the cerebellar cortex(n/μm2)Relative optical density of AT8 positive Purkinje cellsWT+PBS0.032±0.0010.001±0.0000.068±0.0033xTg-AD+PBS0.012±0.001??0.001±0.000??0.113±0.005??WT+scFv170.036±0.0010.001±0.0000.065±0.0023xTg-AD+ scFv170.028±0.002##0.002±0.000##0.097±0.002##

**P<0.01vsWT+PBS group；##P<0.01vs3xTg-AD+PBS group

3 討論

AD作為常見的神經(jīng)退行性疾病之一，研究者們除了對其病因、發(fā)病機制、病理，尤其是認知功能進行探究以外，在發(fā)掘AD步態(tài)改變方面也取得了重大進展。AD患者較正常人更容易摔倒，平衡能力更差[19]。以往研究結(jié)果表明，早期病人或者輕度認知障礙(MCI)患者的小腦共濟失調(diào)步態(tài)變化不明顯或者不存在，而家族性伴有基因突變的嚴重癡呆病人常伴有小腦共濟失調(diào)步態(tài)。如AD患者早期出現(xiàn)雙腿支撐時間延長，步幅減小，但步幅寬度無變化[20]，PS1-E280A 家族性AD(FAD)患者有小腦共濟失調(diào)癥狀和運動障礙[21]，攜帶Osaka (E693)突變體的家族性AD患者有著嚴重的癡呆和小腦共濟失調(diào)癥狀和步態(tài)紊亂[22]。在本實驗中，我們采用3xTg-AD轉(zhuǎn)基因小鼠作為實驗?zāi)Ｐ褪?，選取更能反映小腦功能的步幅寬度，搖擺時間和站立時間為主要測試指標。步幅寬度是指左右兩足間的橫向距離，是反映步態(tài)穩(wěn)定性的指標。步幅寬度越窄，步態(tài)的穩(wěn)定性越差。站立相與搖擺相的時間之比可以評定步態(tài)的對稱性。我們發(fā)現(xiàn)12月齡3xTg-AD小鼠后爪步幅寬度明顯增大，站立時間和搖擺時間百分比明顯改變，提示12月齡3xTg-AD小鼠出現(xiàn)了小腦共濟失調(diào)步態(tài)，運動協(xié)調(diào)和平衡能力受損。這說明認知嚴重受損的大月齡3xTg-AD小鼠出現(xiàn)了小腦共濟失調(diào)步態(tài)變化，運動協(xié)調(diào)和平衡能力嚴重受損。

小腦是控制機體運動協(xié)調(diào)性和平衡的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，小腦萎縮多由于浦肯野細胞死亡引起，而浦肯野細胞作為小腦皮層的唯一傳出神經(jīng)元，在小腦回路中扮演著中心作用，它的損害/退化表現(xiàn)為共濟失調(diào)、異常的肢體運動和步態(tài)[13,14]。AD患者和不同種類的AD轉(zhuǎn)基因模型鼠的小腦有著同海馬相似的病理改變，這一點在大量研究中已得以證實。APPswe/PS1dE9小鼠18/20月齡時小腦蚓部面積小于野生型對照組；6月齡的小腦中幾乎沒有斑塊，但是12月齡出現(xiàn)斑塊，18/20月齡的斑塊更多，且主要分布在分子層，少數(shù)分布在顆粒細胞層；18/20月齡的浦肯野細胞和藍狀細胞數(shù)目減少[23]。本實驗結(jié)果顯示，3xTg-AD小鼠在12月齡時才出現(xiàn)步幅寬度增加等運動協(xié)調(diào)及平衡能力下降的現(xiàn)象。我們猜測大月齡AD轉(zhuǎn)基因小鼠小腦共濟失調(diào)癥狀的出現(xiàn)可能與小腦嚴重病理改變，Aβ斑塊出現(xiàn)較晚，繼而引起浦肯野細胞損傷出現(xiàn)較晚有關(guān)。

長期以來，人們認為Aβ是治療AD的重要靶點[15,16]，做了大量的針對Aβ的免疫治療。在斑塊沉積早期階段(5～6月齡)以及有大量Aβ沉積和膠質(zhì)增生的大月齡(24月齡)，對APPswe/PS1dE9 小鼠進行抗pE3-Aβ單克隆抗體mAb被動抗免疫治療，減少了海馬和小腦中Aβ[24]，單鏈抗體scFv-h3D6 能夠保護3xTg-AD小腦深部核團神經(jīng)元[25]。我們實驗室利用噬菌體展示肽庫技術(shù)合成的scFv17抗體，是針對Aβ31-355個氨基酸序列作用的單鏈可變片段，能夠在清除Aβ的同時不會因為作用于Aβ的N端而增加可溶性Aβ寡聚體[17]，因此大大減輕了副反應(yīng)。本實驗采用鼻飼給藥的方法，進一步觀察了scFv17對3xTg-AD小鼠步態(tài)和相關(guān)小腦病理變化的影響。實驗結(jié)果顯示，長期鼻飼scFv17可使12月齡的3xTg-AD小鼠后爪步幅寬度減小，搖擺時間延長，站立時間縮短，這表明長期鼻飼scFv17改善了大月齡的3xTg-AD小鼠的運動協(xié)調(diào)和平衡能力。之后本研究免疫組化結(jié)果顯示，3xTg-AD 小鼠小腦內(nèi)Aβ斑塊和胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)NFT與正常組相比明顯增加，但給予了scFv17后，兩者的含量均明顯下降。此外，scFv17還上調(diào)了3xTg-AD小鼠小腦浦肯野纖維胞漿尼氏小體數(shù)量。之前曾有實驗證實，9月齡的APP/PS1小鼠和3xTg-AD小鼠小腦皮質(zhì)內(nèi)沉積的Aβ會損害神經(jīng)細胞尼氏小體，破壞細胞[26-29]。因此，scFv17改善浦肯野細胞損傷可能與其清除Aβ功能有關(guān)。

綜合上述實驗結(jié)果，我們推測AD小鼠步態(tài)行為的改變也可能與小腦內(nèi)Aβ沉積有關(guān)。scFv17可能因為清除Aβ斑塊而進一步改善Aβ斑塊的繼發(fā)性病變NFT，保護浦肯野細胞，繼而對抗3xTg-AD小鼠步態(tài)行為的變化。